蛋白质含量测定-考马斯亮蓝染色法解析

实验一蛋白质含量的测定—考马斯亮蓝G-250染色法朱新霞18999537938车召堂13565556260史梦婷13399939695实验室规则考勤实验操作实验室安全（仪器、药品、水、电等）值日（桌面、地面、门、窗、水、电等）考试①实验名称②实验目的③实验原理（简述)④实验材料、仪器及其试剂⑤实验方法与操作步骤（工艺流程图或表格方式）⑥实验结果及分析（实验现象或实验结果数据整理、归纳、分析和对比）⑦讨论（实验方法、操作步骤、实验正(异)常结果、建议等）标准的实验报告应该简洁明了地给出使别人能够重复你的实验所需要的全部信息。关于实验报告:要用自己的实验记录认真地写出一份实验报告，不得互相抄袭。实验报告的内容:蛋白质（protein）：是由α-氨基酸按一定序列通过肽键缩合而成的具有一定功能的生物大分子。蛋白质的组成单位：氨基酸。蛋白质的元素组成元素CHONSP其他百分比50-556-720-23160-30-3根据功能不同，蛋白质可分为：1、结构蛋白质：建造和维持生物体结构的蛋白质；2、酶：具有催化功能的蛋白质；3、调节蛋白质：具有调控功能的蛋白质；4、转运蛋白质。1、学习利用考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理及方法；2、掌握分光光度计的使用方法；3、掌握标准曲线的绘制。一、实验目的：考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中游离状态下为棕红色。当它与蛋白质通过范德华键结合后变为蓝色.蛋白质染料复合物对595nm可见光有最大光吸收.在一定范围内（10-1000ug/ml）其OD595nm值与蛋白质含量成正比，故可用分光光度法进行蛋白质的定量测定。二、实验原理：考马斯亮蓝G-250染色法原理465nm595nm酸性环境下呈棕红色与蛋白质结合变蓝色加入蛋白质双缩脲反应：Folin-酚试剂法（Lowry法）：紫外吸收法：微量凯式定氮法：其他蛋白质含量的测定方法（1）双缩脲法：原理是蛋白质含有两个以上的肽键（-CO-NH-）因此，有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，故可以用来测定蛋白质含量.几种其他蛋白质含量的测定方法（2）Folin-酚试剂法（Lowry法）：是双缩脲法的发展，第一步涉及到碱性溶液中铜蛋白质复合物的形成，然后这个复合物还原磷钼酸－磷钨酸试剂，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝混合物）比双缩脲法灵敏，但费时；（3）紫外吸收法：蛋白质中Trp，Phe，Tyr的残基中的苯环含有共轭双键，吸收高峰在280nm处，所以蛋白质具有吸收紫外光的性质，并且蛋白质溶液的光吸收值与其含量成正比，可用作定量测定。简单、灵敏、快速、不耗样品，低浓度的盐类不干扰。（4）微量凯式定氮法：根据蛋白质的平均含氮量为16%，因此，测得1g蛋白氮，相当于6.25g蛋白质。1、实验材料：绿豆芽、小麦种子、葡萄、苹果2、仪器：(1)S-22pc可见光分光光度计(2)研钵(3)离心机(4)试管(5)容量瓶等3、试剂：（1）染色液：考马斯亮蓝G-250(100mg考马斯亮蓝溶于50ml95%乙醇，加100ml85%磷酸，加水稀释至1L)（2）浓度：0.25mg/ml的牛血清白蛋白标准溶液。三、实验材料、仪器和试剂：1、制作标准曲线：取7支试管，依次分别加入0.0，0.10,0.15,0.20,0.30,0.40,0.50ml的牛血清蛋白溶液，用水补足到0.5ml，每管均再加5ml染色液，立即摇匀，置室温下放置5分钟。然后测各管的OD595nm值，绘制标准曲线。四、实验步骤：标准曲线的绘制目的：得到样品中蛋白质的浓度。首先，用一组已知浓度的蛋白质溶液与考马斯亮蓝G-250反应,然后在595nm处测定吸光度（OD）。其次，绘制浓度与吸光度对应的曲线图。最后，测定样品蛋白质的吸光度然后在曲线上找到对应的浓度。1、制作标准曲线：编号1(空白）234567样品标准蛋白(ml)0.00.10.150.20.30.40.50.5ml水(ml)0.50.40.350.30.20.10.0浓度(mg/ml)0.00.050.0750.10.150.20.25C0染色液(ml)55555555OD值四、实验步骤：标准蛋白质浓度OD值0样品OD值C00.050.0750.10.150.20.25OD1OD2OD3OD4OD5OD6标准曲线的制作（图）y=ax+bR2=称取豆芽叶片1g→研钵中加2ml水→研成匀浆→转入离心管→用水分三次冲洗研钵，每次2ml→均转入同一离心管→等重后8000转/分离心10分钟→取上清液转入25ml容量瓶→定容。2、样品蛋白质提取：取0.5ml提取液于试管中,加入考马斯亮蓝G-250染色液5ml，充分混匀，放置5分钟，以制作标准曲线的1号试管为参比溶液，调吸光度为“0”，测豆芽提取液的吸光度A595nm，记录结果，查标准曲线，得蛋白质浓度X(mg/ml)。3、测定：五、结果计算：样品蛋白质含量（mg/g）=[C0·提取液的总体积]/样品鲜重(g)分光光度技术利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计.红外吸收光谱：波长范围2.51000m,主要用于有机化合物结构鉴定。紫外吸收光谱：波长范围200400nm（近紫外区）可用于结构鉴定和定量分析。可见吸收光谱：波长范围400750nm，主要用于溶液等的定量分析。光吸收定律：朗伯—比尔(Lambert-bee)光吸收定律：A＝lg（I0/It)＝-lgT＝εbc（1）A—吸光度“OD”：描述溶液对光的吸收程度；同一种溶液对不同波长光的吸光度是不相同的，在吸光度最大处所对应的波长称为最大光吸收处。同一种物质不同浓度的吸光度，在某一定波长下有差异，在最大光吸收处吸光度的差异最大。这是分光光度法进行物质定量分析的重要依据。I0：表示入射光强度，It：表示光线通过溶液后的强度。（2）T—透光度：描述入射光透过溶液的程度；（3）ε—摩尔吸光系数(是溶液的特征常数)，在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度；单位mol·L－1；（4）b—样品光程（cm），通常使用1.0cm的吸收池，b=1cm（5）C—样品浓度（mol/L）由上式可以看出：吸光度OD与物质的浓度“C”和溶液吸光的厚度成正比。A＝lg（I0/It)=-lgT＝εbc分光光度计的组成和构造：（1）光源；（2）单色器（3）吸收池；（4）接收检测放大系统(检测器)；（5）信号指示系统(显示或记录器)。⑴光源：用于可见光光源是钨灯和卤钨，现在最常用的是卤钨灯（Halogenlamp），适用波长范围是320～1100nm。用于紫外光区的是氢灯和氘灯适用波长范围是195～400nm。⑵单色器：单色器是分光光度计的心脏部分。把来自光源的混合光波分解为单一波长的光能随意改变光的波长。单色器一般由入射狭缝、准光器（透镜或凹面反射镜使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等几部分组成。其核心部分是色散元件:主要是棱镜和光栅⑶吸收池吸收池（即比色杯）：用来盛装被测试的溶液。光学比色杯和石英比色杯两种。光学比色杯适用波长范围是400nm～2000nm，只能用于可见光。石英比色杯可透过紫外光、可见光和红外光，是最常使用的吸收池，使用波长范围是180nm～3000nm。光程可由0.1cm至10cm，最常用的是1cm池（容积3ml）吸收池使用注意事项：①比色杯在使用前后都要彻底的清洗。②严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。③严禁用硬纸和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸布。④严禁加热烘烤。急用干的杯子时，可用酒精荡洗后用冷风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。⑷检测器：检测器是一种光电转换设备，即把光强度以电讯号显示出来，常用的检测器有光电管，光电倍增管和光电二极管等。⑸显示装置：分光光度计现在已都使用数字显示，有的还连有打印机。高性能分光光度计均可以连接微机，而且有的主机还使用带液晶或CRT荧屏显示的微处理机和打印绘图机，有的还带有标准软驱，存取数据更加方便。偏离朗伯—比耳定律的原因标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯—比耳定律的偏离。引起这种偏离的因素（两大类）：（1）物理性因素，即仪器的非理想引起的；（2）化学性因素。（1）物理性因素难以获得真正的纯单色光。朗伯—比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导致对朗伯—比耳定律的正或负偏离。非单色光、杂散光、散射光和反射光、非平行入射光都会引起对Beer-Lambert定律的偏离，最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。(2)化学性因素•朗—比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；假定只有在稀溶液(c10-2mol/L)时才基本符合。当溶液浓度c10－2mol/L时，溶液中溶质可因浓度改变而有离解、缔合、互变异构、配合物的形成和与溶剂间的作用，使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。例：铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：CrO42-＋2H＋=Cr2O72-＋H2O溶液中CrO42-、Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相同。故：朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。四、实验步骤1、分光光度计的使用透明溶液吸光度的测定步骤预热设定波长置入空白溶液调100%T，0%T置标尺为“吸光度”样品置入光路读出数据离心机使用方法1、打开电源开关，按要求装上所需的转头，将预先等重平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。2、按功能选择键，设置各项要求：温度、速度、时间，按启动键，离心机将执行上述参数进行运作，到预定时间自动关机。3、待离心机完全停止转动后打开机盖，取出离心样品。1列出原始数据，包括标准曲线各浓度蛋白质的吸光度（A595nm），样品吸光度（A595nm）2绘制标准曲线，算出相关系数和回归方程。3列出计算过程，根据回归方程，计算出豆芽中蛋白质的含量。豆芽蛋白质含量=xmg/g（每克豆芽中蛋白质的质量（mg数））实验结果