Western-Blot实验(蛋白质印迹法)

WB实验细节详述时间：2016-05-07一：蛋白定量（实验前处理）•组织：到手的组织状态：冰袋快递：组织腐烂，蛋白含量减少干冰快递：基本无影响甲醛处理：石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒需用匀浆器，液氮等方法加入1*PBS充分研磨裂解液量：组织（g）：裂解液（ml）=1:10细胞：一般为细胞悬液实验前需确定细胞大概浓度裂解液量：107数量细胞加入1ml裂解液一：蛋白定量（裂解液详述）裂解液使用时加入PMSF：1ml裂解液加1ulPMSFPMSF（苯甲基磺酰氟）是一种蛋白酶抑制剂，可抑制丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）PMSF在水液体溶液中不稳定，见水易分解，需使用前加入。RIPA裂解液：（100ml体系）试剂名称配方作用Tris(pH7.4)50mM生物缓冲液NaCl150mM让蛋白处于正常条件下，避免蛋白构象改变TritonX-100中性去垢剂1%保持蛋白天然构象，提高细胞膜的通透性sodiumdeoxycholate（脱氧胆酸钠）阴离子去垢剂1%裂解细胞，溶解蛋白（尤其是难溶于水的膜蛋白）SDS阴离子去垢剂0.1%破坏蛋白分子的二、三级结构使分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。一：蛋白定量（原理）•在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此制作标准曲线做对比，即可计算待测蛋白的浓度。一：蛋白定量（实验过程）•加标样+水（共10ul）样品5ul+水5ul•混匀放置37℃培养30min,测OD值，562nm标样(ul)01246810水(ul)10986420加入200ul（A+B)工作液，A液：B液=50:1一：蛋白定量（数据处理）OD蛋白浓度（ug/ul）最大上样量为35ul蛋白浓度30ug保证每个孔蛋白量相同二：聚丙烯酰胺凝胶电泳（配胶）•分离胶试剂分离胶浓度6%8%10%12%15%18%分子量（kDa)≥9470-9455-7020-5510-20≤10去离子水（ml）5.34.64.03.32.31.330％丙烯酰胺（ml）22.73.34.05.06.01.5MTris－HCl（PH8.8）（ml）2.52.52.52.52.52.510％SDS（ml）0.10.10.10.10.10.110％AP（ml）0.10.10.10.10.10.1TEMED（ul）0.0080.0060.0040.0040.0040.004总体积（ml）10ml（两块胶的量）作用：使蛋白样品分离对于分离胶来说，pH8.8与甘氨酸的pka接近，从而使不同分子量的蛋白产生不同的泳动速度，从而使不同分子量的蛋白分开。二：聚丙烯酰胺凝胶电泳（配胶）•浓缩胶作用：使蛋白样品浓缩对于浓缩胶来说，pH6.8可以通过甘氨酸和和氯离子的作用产生压缩，从而使蛋白条带压细。试剂浓缩胶浓度5%水（ml）230％丙烯酰胺（ml）0.51.0MTris－HCl（PH6.8）(ml)0.3810％SDS（ml）0.0310％AP（ml）0.03TEMED（ul）0.03总体积（ml）3（两块胶的量）•制分离胶时10%AP加入后迅速混匀再加TEMED制胶，沿壁灌注，灌注时尽量不要产生气泡，如有气泡，用移液器将气泡吸出，留出浓缩胶所需空间（梳齿长再加1cm）。•覆盖水层于分离胶溶液上，夏天将制胶器放室温20min，冬天放37度培养箱20min-30min•待分离胶和水层之间会出现清晰界面，表明分离胶充分聚合（可微微倾斜模具，检测凝胶是否聚合），倒掉并用滤纸吸干水•在已聚合分离胶上直接灌注浓缩胶液体，立即插入加样梳（缓慢插入，避免产生气泡）。将凝胶在室温或者37℃静置20-30min（视具体情况而定），直到浓缩胶完全凝固。二：聚丙烯酰胺凝胶电泳（配胶）配胶过程要点：灌制分离胶隔绝空气灌制浓缩胶插入梳子二：聚丙烯酰胺凝胶电泳（原理）•主要依据蛋白质的分子量对其进行分离•SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。二：聚丙烯酰胺凝胶电泳（原理）•在浓缩胶中：在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子，Cl离子、甘氨酸阴离子以及蛋白质－SDS复合物，在浓缩胶的pH6.8下，甘氨酸只有少量的电离，所以其电泳迁移率最小，而Cl离子的电泳迁移率最大。在电场的作用下，Cl离子最初的迁移速度最快，这样在Cl离子后面形成低离子浓度区域，即低电导区，而低电导区会产生较高的电场强度，因此Cl离子后面的离子在较高的电场强度作用下会加速移动。达到稳定状态后，Cl离子和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。而蛋白质－SDS复合物由于相对量较少，聚集在甘氨酸和Cl离子的界面附近而被浓缩成很窄的区带（可以被浓缩三百倍），所以在浓缩胶中Cl离子是快离子（前导离子），甘氨酸是慢离子（尾随离子）。在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.8，分离胶pH8.8；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。•当甘氨酸到达分离胶后，由于分离胶的pH8.8，甘氨酸离解度加大，电泳迁移速度变大超过蛋白质－SDS复合物，甘氨酸和Cl离子的界面很快超过蛋白质－SDS复合物。这时蛋白质－SDS复合物在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳，向正极移动。由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。•溴酚蓝指示剂是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位置。当指示剂到达凝胶底部时，停止电泳，从平板中取出凝胶。二：聚丙烯酰胺凝胶电泳（装胶）•取凝固好的SDS-PAGE胶，将凝胶放入电泳槽内，将电泳缓冲液加入内外电泳槽中，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中，小心拔出加样梳。二：聚丙烯酰胺凝胶电泳（上样）•将处理好的蛋白样品按照预定的顺序用移液器加到SDS-PAGE胶上样孔内，最后记得点上预染蛋白质分子量Marker。•对于10孔梳子1mm厚度凝胶，每孔上样量（蛋白质混合物）约30ug。二：聚丙烯酰胺凝胶电泳（电泳）•将电极插头与电源上对应的电极连接，电流应流向正极；•将电压调至80V，预计20min后待染料迁移至分离胶时，将电压调至100V，60min待溴酚蓝到达凝胶底部时，停止电泳，关闭电源，从电源上拔掉电极插头，从平板中取出凝胶。•电压可以根据具体情况作适当调整，但是不能电压过大，电压过大易导致内槽因电泳液温度过高出现胶融或条带变形。三：转膜（原理）•Westernblotting转膜一般采用“滤纸-凝胶-膜-滤纸”夹心法，凝胶靠近负极，膜靠近正极。因为蛋白上结合有SDS，因而带负电，在电流的作用下会从负极向正极运动，从而转移到膜上。•10x转膜缓冲液：Tris30.3gGly151.1g加超纯水至1L（使用前进行冷却）•1x转膜缓冲液（4度保存）200ml甲醇720ml水80ml10x转膜缓冲液甲醇能使SDS与蛋白分离，使蛋白充分转到膜上，甲醇浓度越高SDS与蛋白分离越快，但高浓度的甲醇对蛋白会有固定作用，不利于蛋白从胶里跑出来。一般来说甲醇的浓度为20%甲醇的另一个作用是降温，电转液由于电解质的消耗和甲醇的挥发，电转时电流或电压变化更快、温度升高也更快三：转膜（PVDF膜）•PVDF膜是用来吸附从各种凝胶中转印的蛋白质的最佳用膜。这种疏水膜呈均一控制的孔结构，具有极强的吸附生物分子的能力。与硝酸纤维素膜相比，PVDF膜具有易于操作，染色性能好、抗溶剂能力强和信噪比高的特点，提高了检测的灵敏度。其开放的孔结构使其容易接近被吸收的蛋白质，并去除背景上没有吸附的探针。可以说，它是免疫检测理想的印迹膜。三：转膜（操作过程）•剥胶：用切胶板切去浓缩胶和多余的分离胶•准备滤纸和硝酸纤维素膜，切滤纸和膜时一定要戴手套，大小与胶一致•镊子、切胶板、浸泡胶、滤纸和海绵垫用1x转膜液浸泡，PVDF膜用甲醇浸泡开门通风•三明治的制作：按顺序在转移夹内放置海绵、3层滤纸、胶、膜、3层滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。组装顺序：转膜夹黑色面（负极）－海绵垫－滤纸－胶－膜－滤纸－海绵垫－红色面（正极）。切记：每层之间将其中的气泡全部赶出，组装顺序和电极正确。•转膜：100v60min（冰上电转）转膜时间：根据目的蛋白的大小来调整转膜时间（1KD/1min）四：丽春红染色（原理）•丽春红带负电荷，可以与带正电荷的氨基酸残基结合，同时丽春红也可以与蛋白的非极区相结合，从而形成红色的条带。•丽春红对蛋白的染色是可逆的，染色后可以用蒸馏水，PBS或其它适当溶液洗去。•立春红随时间变长液体内会出现黑色沉淀，多个月后需重新配置四：丽春红染色（过程）•转膜完成后用镊子取出PVDF膜放入容器中用丽春红浸没•1-2分钟后待有明显条带将丽春红回收，用清水漂洗多次直至滤去液体无明显红色•将膜放入容器中准备封闭五：封闭（原理）•惰性蛋白质或非离子去污剂可以结合膜上的未结合位点从而降低抗体的非特异性结合。•封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的标位、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。•最常见的封闭剂是BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和Tween-20（0.05-0.1%）稀溶液。五：封闭（过程）•丽春红染色漂洗完成后。•清洗干净的膜放入盛有5%BSA的容器中，室温封闭60-90min，或者4度过夜。•5%BSA：秤取2gBSA加40ml1xPBS(或TBST)六：一抗孵育（查询抗体）决定二抗属性条带大小适用实验一抗稀释比例六：一抗孵育（过程）•封闭完成前，参照说明书将一抗用5%BSA稀释到足够实验需求的量（无特殊要求，一抗稀释液用封闭液）。•封闭完成后，从膜上剪下宽度为1.5cm左右相应蛋白大小条带，倒掉封闭液，加入稀释好的一抗溶液，摇床上平缓摇动，室温孵育120min或4℃孵育过夜。•一抗孵育完成后，倒掉一抗溶液（有回收要求的抗体，回收一抗溶液4℃保存），用TBST漂洗膜4次，第一次漂洗主要漂洗BSA，冲刷后便可倒去，TBST可以加至膜漂浮在液体中，每次10min。10xTBS配方：Tris:24.2gNacl80gPH调至7.6配制成1*TBST时100ml10*TBS定容至1L加3mlTween20七：二抗孵育（过程）•一抗孵育完成前，将对应一抗种属的酶标二抗1：2000稀释到实验需要的量（5%BSA稀释）。•将清洗好的膜放入盛有二抗溶液的容器中，摇床上缓慢摇动，于室温孵育60min。•二抗孵育完成后，倒掉二抗溶液（可回收抗体，回收二抗溶液4℃保存），用TBST漂洗膜4次，漂洗方式和漂洗一抗相同，每次30min。八：ECL发光（原理）•一般的发光试剂含鲁米诺和H2O2、发光增强剂等物质。发光试剂中的鲁米诺被HRP和H2O2氧化，产生荧光，这个过程被发光增强剂加强，增强剂在HRP-鲁米诺-H2O2体系中扮演着核心角色。八：ECL发光（化学发光成像系统过程）•将漂洗好的膜放入