RT-PCR

Real-timefluorescencequantitativePCR常规PCR结合电泳分析方法的局限性只能对终产物进行分析，无法对起始模板准确定量必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析，费时费事而且EB有毒无法对扩增反应实时检测定量PCR定量PCR是在普通PCR基础上进一步发展的产物，比普通PCR具有更高的灵敏性，准确性和可操控性,可以容易对微量基因表达进行检测并定量。定义：以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，对PCR起始模板量的定量。根据定量方式不同，定量PCR又可细分为两大类：绝对定量:通过荧光PCR仪对未知样品的绝对量进行测定的方法，但必需使用已知浓度的标准品作标准曲线。相对定量:通过分别测定目的基因和参比基因的量，再求出参比基因的目的基因相对量，最后再进行样品间相对量的比较。但不必知道具体浓度，只需要知道相对浓度即可。定量PCR与定性PCR测定最根本的区别定量PCR定性PCR测定点指数扩增期扩增的平台期常规PCR与定量PCR的比较常规PCR定量PCR反应方式2步法3步法2步法3步法反应液成分dNTP，引物，模板，酶dNTP，引物，模板，酶，探针/染料结果检测琼脂糖凝胶电泳ELISA，或实时荧光检测结果性质定性定量，或定性结果准确性无法区别假阳性假阴性有效识别假阳性假阳性SYBRGreenI工作原理Extension5’3’5’3’ExtensionContinuedApplyExcitationWavelength5’3’5’3’TaqTaq3’5’3’TaqTaqRepeatBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllll荧光曲线随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图定量原理•如何对起始模板定量？•通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析•引入二个有关CT值的概念：•Ct值(cyclethreshold)•荧光阈值（threshold）阈值线CycleThresholdorC(t)荧光阈值Threshold：突破背景荧光水平后的荧光值.CtvalueThresholdlineNon-exponentialplateauphaseExponentialphase阈限循环Ct：荧光信号达到阈值时的循环数.突破Ct以后，荧光以指数形式增加,然后线性增加，并最终进入平台期浓度低浓度高模板起始浓度越高，Ct值越小定量原理CT值与模板起始浓度的关系哪个样品浓度高？为什么要用Ct值定量实时荧光定量PCR方法利用Ct的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，该Ct值具有极好的重复性。Ct值的重现性终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性，这是CT值作为定量的指标的重点。Ct值的重现性相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图阈值选择阈值的选择CT值的确定直接与阈值相关，荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上。缺省设置一般是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。但实际应用时要结合扩增效率、线形回归系数等参数来综合考虑。PCR每进行一个循环，产物DNA呈2倍指数关系增长，不久就达到平台期。起始的模板量越大，越早达到检出值，扩增曲线越早起锋。如果将已知浓度标准品进行梯度稀释，会出现一系列扩增曲线。由于Ct值与起始模板的对数值之间存在线性关系，就可制成以下图示标准曲线，这样通过对未知样品在标准曲线上的位置来确定未知样品的起始模板量。定量线性数学原理•理想的PCR反应：•X=X0*2n•非理想的PCR反应：•X=X0(1+Ex)n•n：扩增反应的循环次数•X：第n次循环后的产物量•X0：初始模板量•Ex：扩增效率在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=N(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.方程式(1)两边同时取对数得:lgN=lgX0(1+Ex)Ct(2)=lgX0+Ct*lg(1+Ex)整理方程式(2)得:Ct=-1/lg(1+Ex)*logX0+lgN/lg(1+Ex)(3）Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量定量数学原理TaqMan2、荧光探针法原理荧光探针法有很多种类，最具代表性的的就是TAQMAN探针。•模板目标序列特异结合的水解探针•5’标记荧光报告基团，3’末端标记淬灭基团•利用荧光共振能量转移(FRET)原理RQReporterQuencherRQEnergyLight*Light5’荧光素3’淬灭剂与目标序列互补5’5’3’3’d.NTPsThermalStableDNAPolymerasePrimersAddMasterMixandSampleDenaturationAnnealingReactionTubeTaqlRQProbeRQTaqMan工作原理5’3’RQExtensionStep5’3’1.StrandDisplacementTaq5’3’QTaqR5’2.Cleavage3.PolymerizationComplete5’3’TaqR5’4.Detection5’3’TaqR5’lTaqMan工作原理RQTaqMan实验结果上面介绍了2种荧光检测方法，在具体实验中，我们选用哪种方法好呢?比较两种染料的优缺点？：•优点–仅需要一对引物，实验设计简单。–PCR扩增后可进行产物的熔解曲线分析，以确定特异性。–实验成本低。•不足–特异性仅由引物保证。–非特异性双链DNA也会产生荧光信号。–不能用于多重Real-TimePCR。•优点–靶标特异的荧光信号，高度的检测特异性–信噪比高–可用于多重Real-TimePCR•不足–探针合成成本高–实验设计不够灵活SYBRGreenITaqman