血吸虫病免疫诊断技术规范

血吸虫病免疫诊断技术------现场应用技术规范一、目前常用的血吸虫病免疫诊断类型与方法1)凝集反应直接凝集试验间接凝集试验正向间接凝集试验----间接红细胞凝集试验（IHA）反向间接凝集试验间接凝集抑制试验2)沉淀反应环卵沉淀试验（COPT）3)免疫电泳技术经典的免疫电泳技术对流免疫电泳酶标记抗原对流免疫电泳双向酶标对流免疫电泳免疫印迹技术4)免疫标记技术酶免疫测定---酶联免疫吸咐试验（ELISA）免疫荧光法放射免疫测定法免疫胶体金技术---斑点金免疫渗滤试验（DIGFA渗滤法）免疫胶体染料试验---胶体染料试纸条试验（DDIA层析法）化学发光免疫分析二、未稍采血（塑料管法）操作规程1．采血部位通常取手指或耳垂。耳垂末梢血循环较差，受气温影响较大，冬季最好不用；由于耳垂采血痛感较轻，病人容易接受，可先充分按摩，改善耳垂末梢循环。手指采血应选择无名指。2．采血器材一次性三棱针或弹簧刺血针、75%的酒精、无菌脱脂棉球、聚乙烯塑料管（直径2mm，长8cm）、镊子、酒精灯等。3．采血方法1）以手指按摩采血部位，使局部充血，再用75%酒精棉球消毒皮肤。2）待干后用左手固定采血部位，右手持消毒针迅速刺入皮肤2-3mm，取出刺针，血液即自行溢出。如血流不畅，可于四周稍加压力。3）用消毒干棉球擦去第一滴血液，以后流出的血即可采用。4）用塑料管进血口靠近血滴让血液自行流入管内，采集＞3cm血液(一次检测)。5）采血完毕，刺处用消毒棉球拭擦干净。6）采血后的塑料管将进血端留一小段空隙，靠近酒精灯烧熔管口，用镊子轻轻夹住已基本溶化的采血管进血端约10秒,将进血端牢牢封住,贴上标签。7）塑料管封口端朝下垂直于容器中，待血清自然析出或离心后，剪去塑料管之血球部分，将血清移至中部，用于检测。或两端封口后放冰箱保存备用。4．注意事项采血部位要严格消毒，做到一人一针；采血针忌用注射针头；采血针刺入速度要迅速；有炎症部位不能采血；采血时切忌用力挤压；采血后伤口继续出血应用干棉球压迫；用塑料管收集血液时应尽量避免空气进入管内;如果空气进入管内可将塑料管的另一端位置提高,以排除空气,然后继续采集血液到指定位置可用普通离心机低速(1000-1500转)离心5分钟,以分离血清，防止离心过速或过长。塑料管封口要严密，防止血液流失。用剪刀剪塑料管时应保持剪刀的清洁，避免交叉污染。分离后的血清（或血浆）样品可置冰箱保存。实验废弃物应按照相关规定处理，严禁随意丢弃。三、间接红细胞凝集试验(IHA)操作规程1基本原理抗原吸附于经适当处理的红细胞表面，使红细胞致敏。致敏红细胞与病人血清中特导性抗体（抗SEA特异性抗体）相遇时，在适宜的条件下（电解质、温度、pH），抗原与特导性的抗体相结合，使红细胞出现肉眼可见的凝集反应。为正向间接凝集。2冻干致敏红细胞的制备工艺血吸虫虫卵抗原制备红细胞醛化红细胞鞣化红细胞致敏致敏红细胞的冰冻干燥致敏的新鲜红细胞保存时间短，且易变脆、溶血和污染，只能使用2～3天。新鲜红细胞能吸附多糖类抗原，但吸附蛋白质抗原或抗体的能力较差。为此一般在致敏前先将红细胞醛化，先用甲醛或戊二醛，再用鞣酸处理。醛化红细胞能耐60℃加热，可长期保存而不溶血。并可反复冻融不破碎，在4℃可保存3～6个月，在－20℃可保存一年以上。3实验操作准备1)穿戴好工作服、口罩和手套等，做好基本实验准备工作。2）实验试剂和器材检查和摆放。要求试剂批号与有效期符合产品说明；器材符合相关质量要求。3)检查完毕后，按照实验常规要求摆布好实验试剂和器材。4）实验试剂和器材准备实验试剂盒：1.冻干致敏红细胞（红瓶）2.致敏红细胞稀释液（蒸馏水、红瓶）3.标本稀释液（生理盐水、兰瓶）4.阳性对照品（冻干品、红色）5.阴性对照品（冻干品、兰色）6.使用说明书器材：1.移液器100μl一支、1000μl（1ml）一支、配套吸头、吸头盒及移液器架等2.“V”型反应板一块、白纸一张、记号笔3.旋转震荡器一台4.温箱一台5.实验记录纸、记录笔、废弃物杯5)实验准备要求：待检血清（或血浆）要新鲜，不能有溶血或混有红细胞。应选择“V”型，底角为90度的反应板。不要选择“U”型及不同底角的“V”型反应板。“V”型反应板要清洁、不潮湿，反应孔完好光洁。试剂盒在有效期内4实验操作步骤1)样本编号，从左到右按1～n号排列。2）取一块96孔“V”型反应板横向平放纵向使用。血凝反应板编号：1）横向（行）从左到右编号：1、2、3、……、阴、阳；2）纵向（列）从上到下编号：1:5、1:10、1:20、1:40。3）稀释对照品：阴性对照、阳性对照品各加100μl蒸馏水稀释溶解，加盖混匀后放回原处备用。4）配置致敏红细胞悬液：启开安瓶，以每支冻干致敏红细胞加1ml致敏红细胞稀释液（蒸馏水、红瓶）稀释混匀备用。5)启开标本稀释液（生理盐水、兰瓶）安瓶。6）调节移液器为100μl。血凝反应板的第1行（横向）第1孔各加标本稀释液100μl。7）调节移液器为25μl。血凝反应板的纵向（列）第2～4孔各加标本稀释液25μl。加液完毕，检查每孔是否有漏加孔或加双倍孔，并及时纠正。8）于第一排第1孔加1号待测血清25μl，加完血清（盖上盖子）放回原处，充分混匀（吸打4次，混匀吸打在第一档进行，移液吸头不能触碰反应孔底壁）,使血清成1﹕5稀释。（加血清时要核对一下样本编号防止加错位）。9）在第1孔吸出25μl于第2孔（纵向），同上混匀使血清成1:10稀释。后吸出25μl于第3孔（纵向），同上混匀使血清成1:20稀释。后吸出25μl于第4孔纵向），同上混匀使血清成1:40稀释,后吸出25μl弃去，自动卸去吸头。同上操作进行第2～n号样本、阴性对照、阳性对照倍比稀释。倍比稀释一个样本一个吸头。10）全部样品（及对照）倍比稀释完成后，调节移液器为75μl，然后在第一行（纵列第一孔）吸取75ml弃去，一个样本一个吸头。11)检查每孔液面是否在同一高度，否则应及时纠正。12）充分混匀致敏红细胞悬液（每加若干次要混匀一次），然后在每孔加致敏红细胞悬液25μl（原则上以每个样品为单位即列为单位加液），不需换吸头，但不能触碰反应板，自动卸去吸头。13）先试一试震荡器，正常运转后将反应板震摇1～2分钟，盖上盖子，置37℃(水浴)30min后下垫白纸观察结果。并做好记录。14）记录结果后，实验台面清理：未使用试剂、未使用吸头、移液器（刻度复原至最高档）等放回原处；实验废物放入规定的收集器内。5结果判定1）首先应观察对照管：阴性对照应不出现凝集现象，阳性对照应出现凝集现象，结果方可成立。如出现异常则说明实验操作有误或血球本身有自凝现象，试验结果不能成立。2）根据红细胞凝集程度以“－”，“＋”，“＋＋”，“＋＋＋”记录结果，以呈“＋”凝集的血清最高稀释度作为血清的效价,以效价≥1:10作为阳性判断标准。3）报告形式：1:40阳性（＋＋）4）血凝反应强度的判定如下：－：红细胞全部下沉在孔底，形成肉眼可见紧密、边缘光滑的小圆点。＋：多数红细胞下沉在孔底形成圆点，周围可见少量凝集红细胞，肉眼见周边模糊(或中间出现较为明显的空白点)。＋＋：孔底中心可见少量红细胞下沉的小圆点，多数凝集红细胞在孔底周围形成小薄层＋＋＋：红细胞形成薄层凝集,边缘呈现不规则的皱褶。6注意事项1）结果观察时不能移动反应板，如条件限制则要非常小心慢移，切勿摇动反应板，以免凝集分散，影响结果判断。结果观察时下垫白纸。2）血凝板以96孔“V”型底角应为90度有机玻璃板为适宜，确保所用器材清洁,血凝板清洗不能用毛刷、移液吸头不能触碰反应孔,以避免损坏反应孔,造成假阳性。3）待测血清或血浆不能混有红细胞或被细菌污染。标本不能及时检测可在内4℃度保存2～3天。长时间保存应放冰箱冻存。4）结果判断的时间与温度有关，应根据作业指导书在相同温度相同时间条件下判断。5）使用加样器加样，每测1个样本要更换滴头，在倍比稀释待检血清中，混匀时应避免产生气泡（混匀吸打都在第一档进行）而影响吸量准确性。6）试剂盒于2～8℃避光保存。自检定合格之日起有效期为2年。醛化红细胞能耐60℃加热，并可反复冻融不破碎，在4℃可保存3～6个月，在－20℃可保存一年以上。从冰箱取出使用时先要放室湿平衡一定时间。1基本原理血吸虫病患者血清中存在的抗血吸虫抗体（IgG）与胶体染料标记的日本血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA)相结合，形成染料标记的抗原—抗体复合物，这复合物通过层析技术与固定在硝酸纤维膜上的抗人IgG（二抗）相结合，形成可见的染色带，即为阳性反应。四、胶体染料试纸条法（DDIA）操作规程2实验操作准备1)穿戴好工作服、口罩和手套，做好基本实验准备工作。2）实验试剂和器材检查和摆放。要求试剂批号与有效期符合产品说明；器材符合相关质量要求。3)检查完毕后，按照实验常规要求摆布好实验试剂和器材。4）实验试剂和器材实验试剂盒：1.染料标记液2.试纸条3.PVC小杯4.使用说明书器材：1.移液器50μl一支、吸头、吸头盒及移液器架等2.PVC小杯架、废弃物杯3.实验记录纸、记录笔、记号笔5）要求：1待检血清要新鲜，不能有溶血或混有红细胞3实验操作1）样本编号1～n号，并从左到右按1～n号排列。2）取PVC小杯架子，装上PVC小杯（下垫白纸）3）编号：横向（行）（标在小杯架子上）从左到右编号：1、2、3、……。做好相应实验记录。4）轻轻颠倒混匀染料标记液，确保沉淀完全被混悬。5）调节移液器为50μl。根据样品数每小杯加50μl染料标记液至PVC小杯中。加液完毕，检查每孔是否有漏加孔或加双倍孔，并及时纠正。6）调节移液器为20μl。分别加20μl待检血清（加血清时要核对一下样本编号防止加错位），每个样本缓缓混匀（吸打4次），混匀时应避免产生气泡。整板样本加完后，检查每孔是否有漏加孔或加双倍孔，并及时纠正。7）将整板放手上轻轻震荡，加血清一分钟（含混匀时间）后加试纸条。8）取试纸条插入小杯中，待小杯内反应液吸干后观察结果（15分钟）。9）在光线充足但非强光下观察，正面面向试纸条观察（阳性检测带一般在对照带下0.9cm处，插入杯底斜靠时一般在PVC小杯上沿略上处，防止误判），观察结束放回原处，记录结果。10）实验台面清理：未使用试剂、未使用吸头、移液器（刻度复原至最高档）等放回原处；实验废物放入规定的收集器内。4要求1）标记液混均要轻，倒置时没有沉淀物后再颠倒2次；2）一个样品一支吸头；加血清时要集中注意力切不可漏加或跳管或重叠；3）取试纸条时，用手捏住吸水垫（较长的一端），严禁触摸检测膜或倒捏。4）试纸条一定要入杯底。5）试纸条面向自己排列整齐、一次放好，在结果观察前严禁触碰试纸条和小杯架，也不要做台面清洁工作，防止试纸条顷倒；6）观察结果时要注意光线、方向，不要刻意判断，防止将“固相二抗”的折光误判阳性。5结果判断阳性反应：1）检测带和对照带都出现紫蓝色带。2）检测带出现深紫蓝色带（反应强），对照带显色减弱甚至不显色。阴性反应：对照带出现紫蓝色带而检测带无显色带。无效：检测带和对照带都不出现显色带。6储存条件及有效期试剂盒保存于4-8℃，防止冷冻。有效期6个月。五、酶联免疫吸咐试验（ELISA）操作规程1基本原理1)抗原（日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA）以物理性地吸附于固相载体（聚苯乙烯或聚氯乙烯塑料板）表面（包被），并保持其免疫学活性；2)加待检标本（有相应的特异性抗体）（一抗），即与固相上抗原结合，形成抗原抗体复合物。3)加酶标记的二抗形成Ag-Ab1-Ab2*HRP三联复合物（第二抗体通过共价键与酶连接形成酶结合物---辣根过氧化物酶（HRP）－标记结合物），而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；4)洗涤后加底物和显色剂（H2O2的邻苯二胺（OPD）或四甲基联苯胺（TMB）），酶结合物中的酶再催化底物和显色剂反应，产生显色反应。5)根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因