赤灵芝中醇溶性蛋白提取工艺研究

中国医药生物技术2009年10月第4卷第5期ChinMedBiotechnol,October2009,Vol.4,No.5359DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2009.05.008·论著·赤灵芝中醇溶性蛋白提取工艺研究敖宏，黄生权，陈建旭，曾庆孝【摘要】目的研究不同工艺参数对赤灵芝醇溶性蛋白提取率的影响，为探索赤灵芝醇溶性蛋白的工业化生产提供参考。方法以赤灵芝为原料，采用乙醇提取醇溶性蛋白，并通过单因素实验和正交实验研究浸提时间、温度、pH、液料比及提取次数对醇溶性蛋白提取率的影响，确定赤灵芝醇溶性蛋白提取的最佳工艺。结果单因素实验结果表明，提取时间2h，料液比1:40，醇溶性蛋白含量最高。正交实验得出各因素对灵芝醇溶性蛋白提取率的影响程度大小依次为：pH值料液比提取温度乙醇浓度，醇溶性蛋白提取的最佳工艺参数为：乙醇浓度70%，pH2.5，料液比1:40，提取温度60℃。结论通过单因素实验和正交实验确定了赤灵芝醇溶性蛋白的最佳提取工艺参数，为赤灵芝醇溶性蛋白的工业化生产提供了参考依据。【关键词】灵芝；正交试验中国医药生物技术,2009,4(5):359-363灵芝[GanodermaLucidum(Leyss.exFr.)Karst.]是担子菌纲、多孔菌科、灵芝属的真菌，在我国有两千多年的药用史。灵芝的药用成分非常丰富，已分离到的有效成分就有数十种之多，灵芝蛋白质是除了灵芝多糖和三萜外的另一类重要活性物质。它不仅是灵芝生命活动的重要物质，而且具有独特免疫原性，使其在免疫调节和抗肿瘤病等方面具有显著效果[1]。因此探讨灵芝蛋白的提取工艺对进一步研究灵芝蛋白的结构特征、功能因子和生物活性有着重要的意义。常见的蛋白提取方法有水提、盐提、醇提、酸提和碱提[2]。水提灵芝蛋白条件温和，但是提取率很低[3]。碱法的蛋白提取率高，但强碱容易引起赖氨酸损失，产生不良副产物，还可能造成蛋白质变性和水解[3]。因此本文采用乙醇来对赤灵芝进行蛋白质的提取，探讨影响赤灵芝中醇溶性蛋白浸提的因素，利用正交实验法来进行试验优化，得出最佳工艺参数。1材料与方法1.1材料赤灵芝样品由浙江龙泉市科达农副产品有限公司提供，产地为浙江龙泉灵芝栽培基地，经中科院微生物研究所卯晓岚研究员鉴定为人工栽培赤芝（GanodermaLucidum）；标准牛血清白蛋白购自上海伯奥生物科技有限公司，批号070903；考马斯亮蓝G-250购自上海伯奥生物科技有限公司，批号080605；其它化学试剂如NaOH、CuSO4·5H2O、K2SO4、浓H2SO4、无水乙醇、H3PO4和硼酸等均为分析纯。pHS-25型pH计为上海精密科学仪器有限公司产品；Spectrumlab22p分光光度计为上海棱光技术有限公司产品；DHG-9000A型电热恒温鼓风干燥箱为上海博讯实业有限公司医疗设备厂产品；KDN-04A定氮仪为上海新嘉电子有限公司产品。1.2方法1.2.1测定方法采用凯氏定氮法（GB5511-1985）和考马斯亮蓝G-250法[4]测定样品中蛋白质的含量，采用105℃恒重法（GB5512-1985）测定样品中水分的含量。1.2.2赤灵芝粉的制备将赤灵芝子实体置于50℃烘箱中干燥、粉碎、过30目筛，得赤灵芝粉并保存。经测定此赤灵芝粉水分含量为13.26%，总蛋白含量（以干物质计）为10.30%。1.2.3醇溶性蛋白的提取称取已制备好的赤灵芝粉2g，按一定的液料比加入蒸馏水，在料液比1:20，温度30℃和pH=7的条件下提取8h后抽滤，用少量去离子水分3次洗涤残渣，抽滤至干，所得滤渣用20ml，浓度为0.5mol/L的NaCl溶液搅拌提取8h，抽滤，用少量去离子水分3次洗涤残渣，抽滤至干，所得滤渣在一定的温度、pH、乙醇浓度下提取一定的时间后，抽滤至干，所得滤作者单位：510640广州，华南理工大学轻工与食品学院（敖宏、黄生权、陈建旭、曾庆孝）；529156广东江门，无限极（中国）有限公司（敖宏、黄生权）通讯作者：曾庆孝，Email：[e-mail]收稿日期：2009-07-09360中国医药生物技术2009年10月第4卷第5期ChinMedBiotechnol,October2009,Vol.4,No.5液置于0~4℃冰箱保存备用。1.2.4赤灵芝中醇溶性蛋白提取率（%）的计算计算公式如下：%100×=灵芝中总蛋白含量样品中醇溶性蛋白含量蛋白提取率2结果2.1蛋白质含量的测定用Bradford法测定其含量，参见文献[5]。2.1.1牛血清白蛋白标准曲线的绘制按文献[5]的方法，取约10mg牛血清白蛋白，精密称定，溶于蒸馏水并定容至100ml，配制成100μg/ml的牛血清白蛋白标准溶液，分别精取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于25ml具塞试管中，分别加入5ml考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，并分别加水补足到6ml，盖上塞子，摇匀，室温静置2min后在595nm波长下比色测定。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线，得回归方程为Y=0.0063X+0.0047（R2=0.9988），线性关系良好。2.2单因素实验2.2.1时间对醇溶性蛋白提取率的影响时间是影响蛋白提取率的一个因素，分别选择提取时间为2、4、6、8、10h来进行实验，考察提取时间对醇溶性蛋白提取率的影响，实验结果见图1所示。可知，随着提取时间的增加，醇溶性蛋白质的提取率未有显著性变化，为节约能源，选取提取时间为2h。蛋白提取率（%）Yieldofprotein(%)2468108.007.006.005.004.003.002.001.000提取时间（h）Extractiontime(h)图1提取时间对醇溶性蛋白提取率的影响（其它参数分别固定为：提取温度30℃，pH4.5，料液比1:20，提取次数1，乙醇浓度70%）Figure1Theeffectsoftimeontheextractionrateofethanol-solubleprotein(Theextractiontemperaturewas30℃,pHwas4.5,material-liquidratiowas1:20,extractionfrequencywas1,theconcentrationofethanolwas70%)2.2.2不同溶剂浓度对醇溶性蛋白提取率的影响分别选取乙醇浓度为10%、30%、50%、70%、90%进行醇溶性蛋白的提取，不同乙醇浓度对蛋白提取率的影响如图2所示。可见在较低的乙醇浓度条件下，醇溶性蛋白的提取率随乙醇浓度的增加而增加，70%乙醇浓度提取的醇溶性蛋白提取率最高，但随着浓度增大，醇溶性蛋白提取率反而下降，故选用70%乙醇浓度为正交优化提取方案的基准参数。2.2.3料液比对醇溶性蛋白提取率的影响分别选取料液比1:10、1:20、1:30、1:40、1:50进行蛋白提取率（%）Yieldofprotein(%)204060801004.504.003.503.002.502.001.501.000.500乙醇浓度（%）Ethanolconcentration(%)图2乙醇浓度对醇溶性蛋白提取率的影响（其它参数分别固定为：提取温度30℃，pH4.5，料液比1:20，提取次数1，提取时间2h）Figure2Theeffectsofconcentrationofethanolontheextractionrateofethanol-solubleprotein(Theextractiontemperaturewas30℃,pHwas4.5,material-liquidratiowas1:20,extractionfrequencywas1,extractiontime2h)蛋白提取率（%）Yieldofprotein(%)1:101:201:301:401:509.008.007.006.005.004.003.002.001.000料液比Material-liquidratio图3料液比对醇溶性蛋白提取率的影响（其它参数分别固定为：提取温度30℃，pH4.5，乙醇浓度70%，提取次数1，提取时间2h）Figure3Theeffectsofmaterial-liquidratioontheextractionrateofethanol-solubleprotein(Theextractiontemperaturewas30℃,pHwas4.5,theconcentrationofethanolwas70%,extractionfrequencywas1,extractiontime2h)中国医药生物技术2009年10月第4卷第5期ChinMedBiotechnol,October2009,Vol.4,No.5361浸提，考察醇溶性蛋白的提取率，结果如图3所示。可知，随着料液比增大，蛋白提取率随之增大，但在料液比增至1:40后，料液比的增加对蛋白提取率的影响不大，但料液比过大会造成溶剂和能源的浪费，且会给浓缩过程带来负担，所以确定料液比为1:40。2.2.4pH对醇溶性蛋白提取率的影响利用盐酸调节灵芝提取前样品的pH[6]，分别选取pH为1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0进行实验，pH对蛋白提取率的影响如图4所示。可见，随着pH值的增大，醇溶性蛋白的提取率不断地增大，但当pH蛋白提取率（%）Yieldofprotein(%)12345676.005.004.003.002.001.000pH值pHvalue图4pH值对醇溶性蛋白提取率的影响（其它参数分别固定为：提取温度30℃，料液比1:20，乙醇浓度70%，提取次数1，提取时间2h）Figure4TheeffectsofpHontheextractionrateofethanol-solubleprotein(Theextractiontemperaturewas30℃,material-liquidratiowas1:20,theconcentrationofethanolwas70%,extractionfrequencywas1,extractiontime2h)蛋白提取率（%）Yieldofprotein(%)102030405060708.007.006.005.004.003.002.001.000温度（℃）Temperature(℃)图5提取温度对醇溶性蛋白提取率的影响（其它参数分别固定为：pH3.0，料液比1:20，乙醇浓度70%，提取次数1，提取时间2h）Figure5Theeffectsofextractiontemperatureontheextractionrateofethanol-solubleprotein(pHwas3.0,material-liquidratiowas1:20,theconcentrationofethanolwas70%,extractionfrequencywas1,extractiontime2h)大于3时，提取率反而呈现出下降的趋势，这可能是因为pH值过高会引起蛋白质发生水解或者变性等不良反应。Hamada[7]建议进行可溶性蛋白提取时pH值最好低于9.0，否则会影响蛋白质营养价值和商用品质，因此，确定浸提时pH值为3.0。2.2.5温度对醇溶性蛋白提取率的影响分别选取30、40、50、60、70℃进行浸提，温度对浸提效果的影响如图5所示。可见，随着温度的升高，蛋白提取率也随之增大，但温度升高到60℃之后，醇溶性蛋白提取率变化不大，这可能是由于过高温度导致蛋白质的结构被破坏，特别是醇溶性中的活性蛋白[3]。2.3正交实验分析以及提取工艺的优化根据单因素试验结果，同时为了防止人为的试验误差，掩盖考察因素的显著性，本试验进行了有重复观测值的正交试验L9（34）设计（见表1），重复试验采用随机单位组设计。试验结果及极差分析见表2和表3，并对其结果进行方差分析（表4）