植物组织培养实验室的组成、仪器设备及基本操作(精要)

植物组织培养实验室的组成、仪器设备及基本操作一、植物组织培养实验室的结构及设计要求：完整的植物组织培养室通常包括洗涤室、化学实验室、接种室、培养室、细胞学实验室等部分。可以根据实际需要和条件进行设计。但从功能上至少包括准备室（化学实验室）、接种室以及培养室三部分，并且按顺序排列。在化学实验室与接种室之间应留有缓冲空间。第一节实验室结构、仪器设备及操作技术（一）准备室（化学实验室）：1.主要功能：用于培养器皿的清洗、干燥、培养基的配制、分装和灭菌、试管苗的出瓶及整理等工作。2.主要仪器设备及用品：药品柜、实验台、水槽、超声波洗涤仪、凉干架、干燥箱、各种玻璃器皿（烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶、三角瓶等）、蒸馏水制造装置。天平、移液器、pH计、水浴锅、微波炉、电炉、磁力搅拌器、蠕动泵、及培养基分装用品等、高压灭菌锅、冰箱。（二）接种室（无菌操作室）：1、功能：接种材料的灭菌、接种以及培养物的继代转接等。接种室要求保持洁净，与化学实验室之间应设置缓冲室。2、仪器设备及用品：超净工作台、紫外灯、小推车、搁架、磁盘、接种工具（各种镊子、解剖刀、手术剪、普通剪刀接种针、酒精灯、手持喷雾器、细菌过滤器等）等。（三）培养室：1、功能：主要用于植物材料的培养。要求室内洁净并能保持一定的温度、光照以及湿度，以促进植物材料的生长和分化。2、仪器设备及用品：培养架及灯管、摇床（振荡器）、空调、自动定时器、加湿及除湿器、光照培养箱等。（四）细胞学实验室：1、功能：主要用于培养材料的显微观察及照相等。2、仪式设备及用品：体视显微镜、普通显微镜、倒置显微镜、荧光显微镜、配套显微照相装置、普通相机或数码相机、切片机及配套制片及染色用品等。体视显微镜用途：放大倍数5~80倍主要用于植物形态分化的观察、茎尖的切取。普通光学显微镜用途：用于植物切片观察，确定植物的发育进程，如：不定芽、不定胚的分化过程以及其它器官组织的分化等。倒置显微镜用途：主要用于细胞、原生质体的细胞分裂和细胞团形成的观察。（一）洗涤：1.普通器皿：采用洗衣粉、洗洁精等中性洗涤剂洗涤。2.难清洗器皿及移液管等：用水清洗后再用重铬酸钾洗液浸泡，最后清水冲洗，或用超声波仪清洗。重铬酸钾洗液的配制方法：43g重铬酸钾溶于1000ml蒸馏水中，将浓硫酸缓慢倒入重铬酸钾溶液中，浓度比例为1：1。二、实验室基本操作：1、器具灭菌：培养皿、解剖刀、镊子等用品。（1）干热灭菌：铝箔包好后，放于恒温干燥箱内，150℃保温2小时，成本较高。（2）高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌锅内120℃15－20分钟。（3）灼烧灭菌：接种时，解剖刀及镊子等浸入95％乙醇，然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌。（二）灭菌：灭菌是指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的所有微生物（包括芽胞），使之呈无菌状态。经过灭菌的物品称“无菌物品”。2、培养基灭菌：采用高压蒸汽灭菌。120℃15－20分钟。培养基体积越大，灭菌时间越长。高温高压灭菌对培养基成分的影响：a.pH值普遍下降。b.产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发生化学反应而产生混浊或沉淀。例如Ca+2与PO4-3化合，就会产生磷酸钙沉淀。c.不少培养基颜色加深。d.体积和浓度有所变化。e.营养成分有时受到破坏。3、不耐高温材料的灭菌：采用过滤灭菌，如IAA、ZT、天然有机添加物等。4、外植体的表面灭菌：采用70－75％乙醇（10-30秒）、有效氯1％的次氯酸钠（5-30分钟）、0.1－0.2%的氯化汞（2-15分钟）等杀菌剂中加入几滴吐温－20或80（Tween－20或80）效果较好。（三）无菌操作：1、保持接种室的无污染环境，定期熏蒸或喷雾处理。接种前打开超净工作台及紫外灯照射20-30分钟，关闭紫外等灯后使气体散出后开始操作。2、保持超净工作台的洁净：接种前用70％乙醇擦拭台面或用喷壶喷雾，操作前，将手和手臂用70％乙醇消毒，所需试验用品用乙醇擦拭后放入超净工作台。3、点燃酒精灯，进行操作，接种材料前后，灼烧瓶口，工具要灼烧彻底，防止交叉污染。4、保持培养室的洁净，发现污染及时挑出，以减少污染源。5、操作中穿工作服、戴口罩、工作帽，出入接种室换拖鞋以保持接种室的洁净。第二章植物组织培养实验室的组成、仪器设备及基本操作第一节实验室结构、仪器设备及操作技术一、植物组织培养实验室的结构及设计要求二、实验室基本操作第二章植物组织培养实验室的组成、仪器设备及基本操作第二节培养基的组成、配制与灭菌一、培养基（medium）的组成和作用通常植物组织培养所用培养基包括以下六大类成分，即矿质营养、有机成分、植物生长调节剂、碳源、琼脂以及其他附加物等。培养基的主要指标是:营养成分的浓度植物生长调节物质的浓度（一）矿质营养：矿质营养又称无机营养，是指植物生长发育所需要的各种化学元素。矿质元素的生理作用：（1）组成各种化合物，成为结构物质；（2）许多酶和附酶的组成部分，参与代谢；（3）维持离子平衡、胶体稳定及电荷平衡等电化学作用；（4）影响形态发生和组织、器官的建成等。根据植物对元素的吸收量，可以把植物必需元素分为大量元素和微量元素。国际植物生理学会规定植物所需浓度大于0.5mmol/l的的元素称为大量元素。低于0.5mmol/l的元素称为微量元素。大量元素：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S分别占植物干重的百分数为18％、10％、70％、0.3%、0.07％、0.3%、0.3％、0.07%、0.05％。微量元素：Fe、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、Cl等。1、大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S等6种大量元素依靠各种无机盐提供。不同植物种类和不同试验目的对元素的使用量要求不同，需经试验确定。目前已选择出多种培养基配方用于植物组织培养。其中以MS应用最广泛。以MS为例6中矿质元素分别由KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO47H2O、CaCl24H2O提供。大量元素中的氮通常采用硝态氮或铵态氮，但铵态氮浓度过高会对有些植物的培养物造成伤害，不适宜使用过高的浓度，可以用谷氨酸、丝氨酸等来代替。2、微量元素：植物组织的对其需要量极少，过多会产生毒害，如造成蛋白质变性、酶失活,代谢障碍等。各种微量元素均具有特定的生理功能，如硼与蛋白质的合成及糖类的运输有关；铜能促进离体根的形成；锰参与植物的光合作用和呼吸作用；钼为氮素代谢的重要元素。微量元素中，铁的用量较大，它对叶绿素的合成起重要作用，由于在较高pH下，FeCl3极易形成Fe（OH）3沉淀，难以被吸收，所以多用乙二胺四乙酸二钠盐与硫酸亚铁形成的螯合物，并且单独配制。（二）有机成分：主要包括各种维生素和氨基酸常用的维生素：硫胺素（VB1）、吡哆醇（VB6）、烟酸（VB3）、泛酸钙（VB5）、生物素、钴胺素（VB12）、叶酸等。常用的氨基酸：甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。有时添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，为牛乳经酶法加工的水解产物，含有20种氨基酸的混合物，用量10－1000mg/L,通常用于原生质体等培养。此外肌醇是另外一种重要的有机成分，在维持离子平衡，糖类的转化中起重要作用，此外还参与磷脂代谢及等生理作用。它可以促进愈伤组织的形成，不定芽、不定胚的分化。（三）植物生长调节物质：植物激素是植物代谢中产生的天然化合物，它能直接影响植物细胞的分化、分裂以及影响植物的形态建成、开花、结实、成熟、衰老脱落、休眠、萌发等生理活动。在植物组织培养中，主要通过植物激素及生长调节物质对离体的组织、器官的形态发生进行调控。包括诱导细胞分裂、愈伤组织的生长、根芽的分化以及体细胞胚胎发生等。常用的植物激素及生长调节物涉及五大类植物激素：1、生长素类：2、细胞分裂类：3、赤霉素类：4、脱落酸：5、多胺6、乙烯：1、生长素类：组织培养中的功能是：促进细胞伸长生长和细胞分裂，诱导形成愈伤组织，促进生根。常用的有NAA、IAA、IBA、2,4－D等。2、细胞分裂素类：功能：诱导芽的分化、促进侧芽萌发；促进细胞分裂和扩大，促进茎增粗，抑制茎伸长；延缓衰老。常用细胞分裂素有BA、KT、ZT、2ip等。此外近年来发现苯基脲衍生物具有非常高的细胞分裂素活性，在多种植物上应用。如TDZ，CPPU，4－PU等。3、赤霉素类：主要具有诱导茎的细胞伸长，对根无效；对形成层细胞分化有影响，与生长素协同作用；可以诱导离体成花；打破休眠等功能。常用GA3、GA4等。4、脱落酸（ABA）：促进休眠、衰老和脱落。组织培养中较少使用，主要用于种质资源的离体保存。5、乙烯：主要促进衰老和脱落，高浓度易形态变化。（四）碳源：碳源主要为细胞提供合成新化合物的骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，此外还能维持一定的渗透压。常用的碳源主要是蔗糖，使用浓度在10－50g/L，此外果糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物组织培养。（五）琼脂：琼脂作为固化剂用于组织培养中，起支持植物的作用，不提供营养，为海藻中提取的一种高分子化合物，仅溶于热水（90oC以上），成为凝胶，冷却后（40oC以下）即凝固为凝胶。琼脂的用量通常在4～10g/L。（六）有机附加物：1、椰子汁：用量为100～200g/L。2、香蕉泥：使用量为150～200g/L。3、苹果汁、番茄汁等。（七）其他成分：1、活性炭：使用量为0.2-1%。2、抗生素：常用青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5～20mg/L。3、抑制酚类物质：抗坏血酸.4、生长抑制剂：常用矮壮素、比久（B9）、多效唑（pp333）、三碘苯甲酸、根皮酚等.二、培养基的类型：1、高盐浓度培养基：MS、B5、SH等。适用于多数营养需求量较大的植物。2、低盐培养基：WPM、White、Nitsh等。适用于木本植物的培养。表1MS培养基的组成配方组成成分数量(mg/l)组成成分数量(mg/l)NH4NO31650Na2-EDTA37.3KNO31900FeSO4·7H2O27.8CaCl2·2H2O440CuSO4·5H2O0.025MgSO4·7H2O370蔗糖30KH2PO4170pH5.8KI0.83肌醇100.0H3BO36.2烟酸0.5MnSO4·4H2O22.3盐酸吡哆醇0.5ZnSO4·7H2O8.6甘氨酸2.0Na2MoO4·2H2O0.25盐酸硫铵等0.4CoCl2·6H2O0.025表2B5培养基的组成和配方组成成分数量(mg/l）组成成分数量(mg/l)KNO32500FeSO4·7H2O27.8CaCl2·2H2O150CuSO4·5H2O0.025MgSO4·7H2O250蔗糖40(NH4)2SO4134pH5.5KI0.75肌醇100H3BO43.0烟酸1.0MnSO4·4H2O10盐酸吡哆醇1.0ZnSO4·7H2O2.0激动素0.1Na2MoO4·2H2O0.252,4－D0.1－1.0CoCl2·6H2O0.025盐酸硫铵10Na2-EDTA37.3表3N6培养基的组成和配方组成成分数量(mg/l)组成成分(mg/l)KNO32.3Na2－EDTA37.3CaCl2·2H2O166FeSO4·7H2O27.8MgSO4·7H2O185蔗糖50KH2PO4400pH5.8(NH4)2SO4463烟酸0.5KI0.8盐酸吡哆醇0.5H3BO31.6甘氨酸2.0MnSO4·4H2O4.4盐酸硫铵1.0ZnSO4·7H2O1.5三、培养基母液及激素母液的配制：由于培养基中元素用量少，种类多，因此每次称量繁琐，因此通常将各种营养成分配制成母液保存。大量元素微量元素有机营养激素1、器皿和用具的准备仪器包括万分之一天平，百分之一天平，pH计用品包括不同型号的烧杯（2000ml、1000ml、100ml），容量瓶（1000ml、500ml、100ml）、移液管（10ml、5ml、2ml、1ml）、试剂瓶若干（1000ml、250ml）、移液器（1000ul、200ul）、滴管、玻璃棒、试管、各种规格三角瓶（150ml、100ml、50ml）、培养基分装器，漏斗、称量纸、标签纸、不同范围pH试纸、铅笔等。玻璃器