艾滋病实验室检测管理与设备维护

艾滋病实验室检测管理与设备维护河北省疾病预防控制中心性病艾滋病预防监测中心赵翠英HIV抗体检测的目的监测:以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势而进行的检测，检测的人群包括各类高危人群和一般人群。诊断:以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况而进行的检测，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。血液筛查:以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV而进行的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。HIV抗体检测的要点筛查试验阳性不能出阳性报告。严格遵守实验室标准操作程序（SOP）。严格按照试剂盒说明书操作。注意防止样品间交叉污染。常规程序•初筛-复检-确认复检：对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的筛查试剂重复检测。如两种试剂复测均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认实验室进行确认。样品筛查检测筛查试剂阳性反应阴性反应重复检测原有试剂加另外一种筛查试剂一阴一阳均阴性反应均阳性反应送确认实验室进行确认阴性报告HIV抗体筛查试验流程图免疫印迹法(HIV1/2混合型)HIV-1阳性反应不确定反应应出现HIV-2指示条带HIV-1阳性报告不确定反应阳性反应阴性反应报告HIV-2血清学阳性必要时测核酸阴性报告免疫印迹法（HIV-2）每3个月随访一次，共2次，仍属可疑，则作阴性报告如随访期间出现阳性反应则报告阳性阴性反应阴性报告HIV抗体确认试验流程图一、HIV抗体诊断临床上实际应用的是测定特异性HIV抗体，包括初筛和确认两个方面。HIV抗体一般在感染后几周逐渐出现，可延续至终身，是重要诊断依据，但是从感染到血清抗体阳转有一段窗口期，平均为1到3个月，还有一小部分比例的HIV感染者出现迟缓反应，95%以上HIV-1感染者产生抗体的时间是在感染后6个月以内。常用样品主要为血液此外还可用唾液检测HIV（Orasure，如Salivacard），尿液检测HIV抗体。常用方法酶联免疫吸附试验（ELISA）明胶颗粒凝集试验（PA）斑点免疫试验（或免疫层析）：胶体金或胶体硒双抗原夹心ELISA试验原理▲此类试验比较敏感和特异，可检测血清中的IgA、IgM、IgG抗体。▲将HIV-1/2混合抗原包被在微孔板底部。“一步法”--实验时加入待检血清和辣根过氧化物酶标记HIV-1/2混合抗原“二步法”--实验时先加入待检血清，温度处理后，再加酶标记HIV-1/2混合抗原双抗原夹心ELISA试验原理▲温度处理后洗涤。待检血清中如有特异性抗体，即将包被抗原和酶标记的抗原桥联在一起，如无抗体，通过洗板而洗去酶标记的混合抗原。加入的底物同被桥联抗原上的酶发生颜色反应，指示抗体存在，如无抗体参与则无显色。▲实验中设阴性对照和阳性对照。明胶颗粒凝集试验(PA)原理以HIV抗原致敏粉红色明胶粒子(载体)。这种致敏载体和血清中HIV抗体相遇被桥联而出现肉眼可见的凝集反应,非致敏的明胶粒子因无抗原参与,则不发生凝集。如果试验中的未致敏粒子对照出现凝集，即提示血清中含非特异性凝集因子，需用未致敏粒子吸附处理，重新做试验。目前已有HIV-1和HIV-2抗原共同致敏的PA试剂（AFDHIV1/2PA）和HIV-1、HIV-2抗原分别致敏的PA试剂（AERODIA-HIV-1/2）。前者可用于HIV1/2的筛查，后者可用于区分HIV-1型和HIV-II型。其缺点是判定结果用肉眼观察，无法保存。目前这问题已得到解决，为了保存试验结果，试剂盒可配备数码相机。雅培Determine（硒标）快速试剂试验原理雅培DetermineHIV1/2快速测试试剂是一种用免疫层析法原理,定性测定血样中HIV1/2抗体。加样本入反应条，当样品通过硒胶体-抗原结合物时，与硒胶体-抗原结合物混合重组结合，此混合物继续迁移通过固相包被的合成肽和重组抗原的结果窗。如果样品中含有HIV1/2抗体，其抗体将会与硒胶体-抗原结合，并在窗口处被固相包被的合成肽和重组抗原所捕获固定，形成一条红线。如果样品中不含HIV1/2抗体，则无红线形成。为了保证结果有效，在反应条中含有质控条带。金标快速试剂试验原理CHEKHIV-1+2（EY）将HIV抗原吸附在基膜上，加入待检标本后,如果标本中有HIV-1或HIV-2抗体，抗体便被吸附在基膜的抗原上，加入P-A金标记溶液，而其Fc部位则和P-A金标记物结合,形成如三明治般的粒子，出现肉眼可见的粉红色圆点。窗口期和残余危险度1、窗口期：HIV感染后至抗体检出前的一段时间称为窗口期。2、残余危险度(residuerisk)：在目前条件下，筛查后仍具感染性的机率。影响残余危险度的主要因素包括窗口期、试剂质量、实验室质控以及人群感染率等。各国的残余危险度不一，美国1985年是1/2500,随着检测试剂完善，包括“O”亚型的检出、IgM和p24抗原的检测，到1995年降至1/44-66万；据报道非洲为5/1000,泰国1/775,肯尼亚1/50。二、艾滋病病毒的抵抗力HIV抵抗力HIV一旦离开宿主在外界环境中生存能力便很快消失，HIV对环境中的物理因素和化学因素抵抗力均较弱，比乙肝病毒（HBV）的抵抗力低得多。因此，对HBV有效的消毒和灭活方法均适用于HIV。HIV抵抗力--物理因素HIV对热很敏感，对低温的耐受性强于高温。因此，可以用高温灭活HIV，在低温条件下保存HIV。对紫外线不敏感：用紫外线、γ射线不能灭活HIV。HIV抵抗力--物理因素HIV灭活：美国疾病控制中心证明，在干燥环境中的HIV浓度在几小时之内降低90～99%（即降低1～2log）。在室温（22～27℃）液体环境下HIV可存活15天以上；经56℃处理30分钟，可使HIV在体外对人T淋巴细胞失去感染性，但不能完全灭活血清中的HIV；血清中HIV经过60℃3小时或80℃30分钟作用后不能检出感染性HIV。目前，世界卫生组织推荐的逆转录病毒灭活方法是100℃20分钟。HIV抵抗力--物理因素HIV保存：在-70℃不加保存剂冷冻保存，其感染性可丧失。但若在-70℃保存于35%山梨醇或50%小牛血清（FBS）可存活3个月以上，在液氮中（-196℃）HIV可存活数年以上。因此，毒种必须置于液氮中方可长期保存。HIV抵抗力—化学因素HIV耐碱不耐酸：在pH3.0条件下HIV滴度在10分钟可下降4个对数级，而pH值高达9.0时，HIV滴度下降甚微。对含氯消毒剂敏感。0.5％次氯酸、2％戊二醛溶液、3％碘酒、6％过氧化氢可在3～5分钟内灭活HIV。实验常用的消毒办法高压蒸汽灭菌(121℃20分钟)干烤170℃2小时煮沸20分钟消毒剂浸泡30分钟，常用消毒剂为5％可用氯(次氯酸钠、次氯酸钾、氯氨T)、6％过氧化氢、2％戊二醛等。70%酒精1分钟可灭活HIV。三、HIV实验室检测管理艾滋病检测工作规范要点实验室设置国家艾滋病抗体检测参比中心艾滋病抗体确证实验室--卫生部批准艾滋病抗体初筛中心实验室--卫生厅审批艾滋病抗体初筛实验室--卫生厅审批各级实验室承担相应的任务确证实验室职责对初筛实验室人员技术培训对初筛实验室考评或验收对初筛实验室进行年度质控血清考核评估省内所使用的HIV抗体检测试剂省内各级初筛实验室的质控管理艾滋病抗体初筛实验阳性标本的确证向上级部门报告检测工作艾滋病抗体初筛中心实验室职责本地区初筛实验室的技术指导和管理本地区初筛实验室人员的技术培训和咨询本地区初筛实验室的质量管理和质量控制对初筛实验可疑阳性或阳性标本的复检承担艾滋病抗体的初筛实验和咨询汇总本地区艾滋病检测结果并上报初筛实验室的职责艾滋病抗体初筛实验和检测前后的咨询及时向中心实验室送检初筛实验阳性或可疑阳性标本以及需做确证实验的标本作好本实验室的各项管理，如标本登记、实验记录、安全记录等。按规定向上级报告实验室工作和检测的阶段总结初筛实验室的基本条件房屋--清洁区、半污染区、污染区，控温设备--酶标仪、洗扳机、冷藏，微机，高压灭菌器、生物安全柜、洗眼器等人员--3名以上技术人员，含1名中级以上技术职称。全部须经专业技术培训质量保障措施安全保护措施--环境、个人具备各项规章制度HIV抗体检测实验室结构示意1HIV抗体检测实验室结构示意2HIV抗体检测实验室结构示意3人员防护的基本装备隔离衣（一次性）帽子口罩眼镜（依据个人视力配置，不准移出实验室能保护脚面的、便于消毒、清洗的实验室用鞋生物安全柜微生物安全柜microbiologicalsafetycabinet(MSC)生物安全柜biologicalsafetycabinet（BSC）操作危险性微生物时所用的箱形空气净化安全装置，保护使用者和环境不受因为操作产生的有害危险物质和微生物气溶胶的伤害。生物安全柜按防护水平分为I级、II级、III级。为什么使用生物安全柜1.生物安全柜主要用于各种微生物,特别是有害微生物的操作和基因工程操作。2.根本目的是保护工作人员健康和柜外环境安全。3.根据保护对象和程度的不同，生物安全柜分为I、II和III级。生物安全柜的分级1.I级生物安全柜：保护工作人员和环境。2.II级生物安全柜：保护工作人员、环境和样品。3.III级生物安全柜：采用手套箱更严格地保护工作人员、环境和试样（产品）。II级生物安全柜分类1.II级A型生物安全柜：70%柜内循环，30%空气排出，无连接法蓝2.II级B1型生物安全柜:30%柜内循环，3.II级B2型生物安全柜:100%空气排出4.II级B3型生物安全柜：70%柜内循环，30%空气排出，有连接法蓝。5.II级A/B3型生物安全柜：兼顾A型和B3型生物安全柜的选用1.凡进行有害微生物和转基因操作，均应使用生物安全柜，不可用净化工作台。2.根据工作性质和防护要求，选用适当级别和型号的生物安全柜。3.产品质量。4.售后服务。微生物防护性能1.对工作人员的防护性能2.对样品防护性能3.交叉污染防护性能初筛试剂要求*HIV－1/2混合型*卫生部批准文号*卫生部药政局检定所批批检,并贴有防伪标签*进口初筛试剂要有我国的注册证明*敏感性高、操作简便、价格低廉和相对好的特异性,*常用初筛试剂:酶联免疫吸附试验、凝聚试验、免疫斑点试验等。艾滋病抗体检测结果的报告初筛试验结果:*初筛实验室HIV抗体检测的阴性结果，可以出据试验阴性的报告单，并标明所用试剂名称、试剂效期、试验者等内容。可通过咨询通知本人。*初筛HIV抗体阳性，只视为HIV抗体可疑阳性，初筛实验室无权向个人或送检单位报告阳性结果。可出据“HIV抗体待复查”报告。需再次采血送确认实验室作确认试验艾滋病抗体检测结果的报告确认试验结果:*阳性结果，只有卫生部批准的HIV抗体确认实验室有资格出据阳性报告，同时按照疫情报告程序和要求呈报有关部门，并经充分分析具体情况决定通知受检者*阴性结果，将阴性结果报给送检单位，可以通知受检者HIV抗体检测情况报告艾滋病抗体初筛实验室，每月5日前将上月的检测情况报初筛中心实验室；艾滋病抗体初筛中心实验室，每月10日前将本实验室和辖区内各初筛实验室上月的检测情况汇总后，报省艾滋病确认实验室；统一使用“HIV抗体检测数月报表”，参照《全国艾滋病检测技术规范》(2004年版)的附表6（由季报改为月报）。报告方式首选电子邮件方式：以电子版的形式按时发送到[e-mail]路新利收另外----补充说明对于“自愿咨询检测月报表”，要求县（区）级疾病控制机构于每月5号前报市级CDC，市级CDC每月10号前报省级CDC。报告方式：首选电子邮件方式：以电子版的形式按时发送到[e-mail]路新利收四、HIV检测实验室常用设备的维护和校准不同级实验室的必备条件人员条件初筛实验室：有3名以上的医技人员，其中中级卫生技术职称人员1名以上，从事病毒血清学检测技术工作2年以上