色谱技术及相关设备讲义

第四讲色谱技术及相关设备《生物仪器分析》色谱法（chromatography）又称“色谱分析”、“色谱分析法”、“层析法”，是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。是利用混合物不同组分在固定相和流动相中分配系数(或吸附系数、渗透性等)的差异，使不同组分在作相对运动的两相中进行反复分配，实现分离的分析方法。色谱法1色谱法的发展2色谱法的分类3色谱法流出曲线及相关术语4色谱法的原理内容提要色谱法始于二十世纪初，经历了整整一个世纪的发展到今天已经成为最重要的分离分析科学，广泛地应用于许多领域，如石油化工、有机合成、生理生化、医药卫生、环境保护，乃至空间探索等。将一滴含有混合色素的溶液滴在一块布或一片纸上，随着溶液的展开可以观察到一个个同心圆环出现，这种层析现象虽然古人就已有初步认识并有一些简单的应用。Tswett俄国植物学家关于色谱分离方法的研究始于1901年，两年后他发表了他的研究成果一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用，提出了应用吸附原理分离植物色素的新方法。三年后，他将这种方法命名为色谱法（Chromatography），很显然色谱法（Chromatography）这个词是由希腊语中”色“的写法（chroma）和”书写“(graphein)这两个词根组成的，派生词有chromatograph（色谱仪），chromatogram（色谱图），chromatographer（色谱工作者）等。由Tswett的开创性工作，因此人们尊称他为色谱学之父，而以他的名字命名的Tswett奖也成为了色谱界的最高荣誉奖。色谱法发明后的最初二三十年发展非常缓慢。液-固色谱的进一步发展有赖于瑞典科学家Tiselius（1948年NobelChemistryPrize获得者）和Claesson的努力，他们创立了液相色谱的迎头法和顶替法。分配色谱是由著名的英国科学家Martin和Synge创立的，他们因此而获得1952年的诺贝尔化学奖。1941年，Martin和Synge采用水分饱和的硅胶为固定相，以含有乙醇的氯仿为流动相分离乙酰基氨基酸，他们在这一工作的论文中预言了用气体代替液体作为流动相来分离各类化合物的可能性。1951年，Martin和James报道了用自动滴定仪作检测器分析脂肪酸，创立了气-液色谱法。1958年，Golay首先提出了分离效能极高的毛细管柱气相色谱法，发明了玻璃毛细管拉制机，从此气相色谱法超过最先发明的液相色谱法而迅速发展起来，今天常用的气相色谱检测器也几乎是在五十年代发展起来的。七十年代发明了石英毛细管柱和固定液的交联技术。随着电子技术和计算机技术的发展气相色谱仪器也在不断发展完善中，到现在最先进的气相色谱仪已实现了全自动化和计算机控制，并可通过网络实现远程诊断和控制。“色谱法”名称的由来石油醚(流动相)碳酸钙(固定相)}色谱带色谱法起源于20世纪初，1906年俄国植物学家米哈伊尔·茨维特用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散为数条平行的色带。气相色谱和色谱理论的出现1952年马丁和詹姆斯提出用气体作为流动相进行色谱分离的想法，他们用硅藻土吸附的硅酮油作为固定相，用氮气作为流动相分离了若干种小分子量挥发性有机酸。气相色谱的出现使色谱技术从最初的定性分离手段进一步演化为具有分离功能的定量测定手段，并且极大的刺激了色谱技术和理论的发展。相比于早期的液相色谱，以气体为流动相的色谱对设备的要求更高，这促进了色谱技术的机械化、标准化和自动化；气相色谱需要特殊和更灵敏的检测装置，这促进了检测器的开发；而气相色谱的标准化又使得色谱学理论得以形成色谱学理论中有着重要地位的塔板理论和VanDeemter方程，以及保留时间、保留指数、峰宽等概念都是在研究气相色谱行为的过程中形成的。高效液相色谱1960年代，为了分离蛋白质、核酸等不易汽化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1960年代末科克兰、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。1色谱法的发展2色谱法的分类3色谱法流出曲线及相关术语4色谱法的原理内容提要色谱法的分类1根据流动相的物态可分为气相色谱(GC)液相色谱(LC)超临界流体色谱(SFC){2根据固定相的外形分柱色谱平板色谱{平板色谱吸附色谱：利用吸附剂对不同组分的吸附性能的差别而进行分离，常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。包括气---固吸附色谱和液---固吸附色谱。分配色谱：利用不同的组分在两相间的分配系数的差别而进行分离，常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等包括气—液分配色谱和液---液分配色谱。3根据分离机理可分为:离子交换色谱离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。排阻色谱：用化学惰性的多孔性凝胶作固定相，按固定相对样品中各组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。当分子进入色谱柱后，它们中的不同组分按其大小进入相应的孔径内，大小大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部，在色谱过程中不被保留，最早被流动相洗脱至柱外，表现为保留时间较短；大小小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在柱子中滞留时间较长，表现为保留时间较长；其余分子则按分子大小依次被洗脱。1色谱法的发展2色谱法的分类3色谱法流出曲线及相关术语4色谱法的原理内容提要色谱流出曲线及有关术语图4-1基线锋高ht0如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线的线性范围内，色谱峰如果对称，可用Gauss正态分布函数表示：式中：C—不同时间t时某物质的浓度，C0—进样浓度，tr—保留时间，σ—标准偏差。])(21exp[220rttCC1、基线是柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值，即图4－1中O—t线．稳定的基线应该是一条水平直线．2、峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示，如图4－1中B′A3区域宽度色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素．度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：（1）.标准偏差σ即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半，如图4－1中EF距离的一半。（2）.半峰宽W1/2即峰高一半处对应的峰宽，如图4－1中GH间的距离．它与标准偏差σ的关系是：W1/2=2.354σ（3）.基线宽度W即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距，如图4－1中IJ的距离．它与标准偏差σ的关系是：W=4σ2/17.1WW保留值－定性1死时间t0死时间(deadtime)--不保留组分的保留时间不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，如图4－1中O′A′。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度相近．测定流动相平均线速ū时，可用往长L与t0的比值计算。流动相平均线速度0tLu柱长2保留时间tr试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为保留时间，如图4－1O′B．它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间．3校正(调整)保留时间某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间，即保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组份的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定．4．死体积V0指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和．当后两项很小而可忽略不计时，死体积可由死时间与流动相体积流速F0（L／min）计算：V0=t0·F05．保留体积VR指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间t的关系如下：VR=tR·F06．调整保留体积VR′某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积，即VR′=VR-V07．相对保留值γ2.1某组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比，称为相对保留值：12121.2RRRRVVtt由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使用的定性数据．必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比。8分离因子在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值．此时，ri/s可能大于1，也可能小于1．在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要参数．在这种特殊情况下，可用符号α表示：式中tR2′为后出峰的调整保留时间，所以这时α总是大于1的。12RRtt色谱流出曲线上的信息1根据色谱峰的个数，可判断样品所含的最少组份数。2根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析。3根据色谱峰的面积或峰高,可以进行定量分析4色谱峰的保留值及其区域宽度是评价色谱柱分离效能的依据5色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(或流动相)选择是否合适的依据。1色谱法的发展2色谱法的分类3色谱法流出曲线及相关术语4色谱法的原理内容提要色谱分析的基本原理组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？色谱法分析的基本原理色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。(一）分配系数K和分配比kmsccK组分在固定相中的浓度组分在流动相中的浓度1分配系数k如前所述，分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附一脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数见它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即组分一定时，K主要取决于固定相性质组分及固定相一定时,温度增加,K减小试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础选择适宜的固定相可改善分离效果影响K的因素固定相、温度2分配比(容量因子)k分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即msmmk组分在固定相中的质量组分在流动相中的质量K与k都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数。K与k都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。k可直接从色谱图上获得。k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。mmssmsVCVCnnkmm3滞留因子Rs设流动相在柱内的线速度为u，组分在柱内线速度为us，由于固定相对组分有保留作用，所以us＜u．此两速度之比称为滞留因子Rs。rmssttuuR0Rs若用质量分数表示，即对组分和流动相通过长度为L的色谱柱，其所需时间分别为sruLtknnnn