第四章培养基

第四节培养基如何给微生物做饭?培养基（medium，复数media；或culturemedium）是指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合营养料。碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水一、选用和设计培养基的原则和方法（一）配制培养基的4个原则1.目的明确培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养目的不同，原料的选择和配比不同；例如枯草芽孢杆菌：一般培养：肉汤培养基或LB培养基；自然转化：基础培养基；观察芽孢：生孢子培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；微生物细胞组成元素的调查或分析，是设计培养基时的重要参考依据。2.营养协调微生物细胞内各种成分间有一较稳定的比例。在大多数化能异养菌的培养基中，各营养要素间在量上的比例大体符合以下十倍序列的递减规律：要素：含量：H2O＞(～10-1)C源+能源＞(～10-2)N源＞(～10-3)K、Mg＞(～10-5)P、S＞(～10-4)生长因子(～10-6)实验室的常用培养基：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；放线菌：高氏1号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：查氏合成培养基；实验室一般培养：普通常用培养基；遗传研究：成分清楚的合成培养基；生理、代谢研究：选用相应的培养基配方；（1）选择适宜的营养物质营养物质的浓度适宜；营养物质之间的配比适宜；高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑制或杀菌作用。（2）营养物质浓度及配比合适培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和（或）代谢产物的形成和积累，其中碳氮比（C／N）的影响较大。link2发酵生产谷氨酸时：碳氮比为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；碳氮比为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。真菌需C／N比较高的培养基；（素食）细菌需C／N比较低的培养基；（荤食）NH3＞CO(NH2)2＞NH4NO3＞(NH4)2CO3＞(NH4)2SO4含氮量（82％）（46％）（35％）（29.2％）（21％）在同样重量时，在以上各氮源中含氮量以氨为最高，尿素次之，硝酸铵和碳酸铵更次之，而硫酸铵则最低。3.理化适宜指培养基的pH值、渗透压、水活度和氧化还原电势等物理化学条件较为适宜。pH渗透压和水活度氧化还原电位（1）pH各大类微生物都有其生长适宜的pH范围，培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。细菌：pH7.0~8.0放线菌：pH7.5~8.5酵母菌：pH3.8~6.0霉菌：pH4.0~5.8藻类：pH6.0~7.0原生动物：pH6.0~8.0嗜极菌（extremophiles）初始pH通常培养条件：在微生物的生长、代谢过程中会产生引起培养基pH改变的代谢产物，为了维持培养基pH的相对恒定，通常要进行pH的调节。pH的内源调节pH的外源调节pH的调节（2）渗透压和水活度它表示两种浓度不同的溶液间被一个半透性薄膜隔开时，稀溶液中的水分子会因水势（waterpotentiality）的推动而透过隔膜流向浓溶液，直到浓溶液产生的机械压力足以使两边水分子的进出达到平衡为止，这时由浓溶液中的溶质所产生的机械压力，即为它的渗透压值。渗透压（osmoticpressure）是某水溶液中一个可用压力来量度的一个物化指标。与微生物细胞渗透压相等的等渗溶液最适宜微生物的生长；高渗溶液会使细胞发生质壁分离；低渗溶液则会使细胞吸水膨胀，形成很高的膨压，这对细胞壁脆弱或丧失的各种缺壁细胞，例如原生质体、球状体或支原体来说，则是致命的。是一个比渗透压更有生理意义的一个物化指标。它表示在天然或人为环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水的含量。水活度的定量涵义水活度即aw（wateractivity）（3）氧化还原电势（redoxpotential）又称氧化还原电位，是度量某氧化还原系统中还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标。一般以Eh表示，它是指以氢电极为标准时某氧化还原系统的电极电位值，单位是V（伏）或mV（毫伏）。不同类型微生物生长对氧化还原电位的要求不同好氧性微生物：+0.1伏以上时可正常生长，以+0.3～+0.4伏为宜；厌氧性微生物：低于+0.1伏条件下生长；兼性厌氧微生物：+0.1伏以上时进行好氧呼吸，+0.1伏以下时进行发酵。氧化还原电位与氧分压和pH有关,也受某些微生物代谢产物的影响增加通气量(如振荡培养、搅拌)提高培养基的氧分压，或加入氧化剂，从而增加Eh值；在培养基中加入巯基乙醇、抗坏血酸（Vc，0.1%）、硫化氢(0.025%)、半胱氨酸（0.05%）、谷胱甘肽、铁屑、二硫苏糖醇、庖肉（瘦牛肉粒）等还原性物质可降低Eh值。测定氧化还原电势除用电位计外，还可在培养基中加入化学指示剂刃天青（resazurin）进行间接测定。在无氧条件下呈无色（Eh＝-40mV）；在有氧条件下，其颜色与溶液的pH相关；（中性——紫色；碱性——蓝色；酸性——红色）在微量氧时，它呈粉红色。刃天青4.经济节约配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成份,特别是在发酵工业中,以降低生产成本。（1）以粗代精对微生物来说，各种粗原料营养更加完全，效果更好。而且在经济上也节约。大量的农副产品或制品，如麸皮、米糠、玉米浆、酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生饼、蛋白胨等都是常用的发酵工业原料以野生植物原料代替栽培植物原料，如木薯、橡子、薯芋等都是富含淀粉质的野生植物，可以部分取代粮食用于工业发酵的碳源。（2）以“野”代“家”（3）以废代好以工农业生产中易污染环境的废弃物作为培养微生物的原料。例如，糖蜜(制糖工业中含有蔗糖的废液)、乳清(乳制品工业中含有乳糖的废液)、豆制品工业废液、黑废液(造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆)等。工业上的甲烷发酵主要利用废水、废渣作原料,在我国农村，已推广利用粪便及禾草为原料发酵生产甲烷作为燃料。（4）以简代繁某制药厂改进链霉素发酵液中的原有配方，设法减去30-50%的黄豆饼粉、25%的葡萄糖和20%硫酸铵，结果反而提高了产量。（5）以氮代朊以大气氮、铵盐、硝酸盐或尿素等一类非蛋白质或非氨基酸廉价原料用作发酵培养基的原料，让微生物转化成菌体蛋白质或含氮的发酵产物供人们利用。（6）以纤代糖开发利用纤维素这种世界上含量最丰富的可再生资源。将大量的纤维素农副产品转变为优质饲料、工业发酵原料、燃料及人类的食品及饮料。（7）以烃代粮以石油或天然气副产品代替糖质原料来培养微生物。生产石油蛋白；将石油产品转化成一些产值更高的高级醇、脂肪酸、环烷酸等化工产品和若干合成物；对石油产品的品质进行改良，如脱硫、脱蜡等。（8）以“土”代“洋”以国产原料代替进口原料，尽量减少工业成本。国内青霉素发酵工业的迅速发展，依赖于找到了富有中国特色的培养基配方，即用廉价的棉子饼（或花生饼）和白玉米粉代替玉米浆和乳糖。（二）4种方法1.生态模拟直接取用这类天然基质（经过灭菌）或模拟这类自然条件，就可获得一个“初级的”天然培养基来培养相应的微生物。例如，用肉汤、鱼汁来培养细菌；用果汁来培养酵母菌；用润湿的麸皮、米糠培养霉菌；用米饭或面包来培养根霉；用肥土来培养放线菌；用玉米芯来培养脉孢菌（Neurosporaspp.）等。2.参阅文献（1）直接经验（2）查阅、分析和利用一切文献资料上的对自己直接或间接有关的信息3.精心设计各项因素的比较或反复试验优选法或正交试验设计法4.试验比较试验的规模一般都遵循由定性到定量、由小而大地逐步扩大的原则。生态模拟参阅文献精心设计试验比较例如，先在培养皿琼脂平板上测试某微生物的营养要求，然后作摇瓶培养（shakeculture）试验，再进行台式发酵罐培养试验，最后才扩大到试验型发酵罐和生产型发酵罐的规模。二、培养基的种类培养基——微生物的菜谱名目繁多、种类各异（一）按对培养基成分的了解作分类天然培养基组合培养基半组合培养基（二）按培养基外观的物理状态作分类液体培养基固体培养基半固体培养基脱水培养基（三）按培养基对微生物的功能作分类选择性培养基鉴别性培养基基础培养基加富培养基增殖培养基三、培养基的配制配料溶解调pH过滤分装灭菌包扎摆斜面贮存本章小结1.微生物的六大营养要素碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水2.微生物的营养类型按微生物所需碳源和能源的性质分为四大类：化能异养微生物（最多）化能自养微生物光能异养微生物光能自养微生物3.微生物的营养的方式有细胞构造的微生物营养方式都是渗透营养型。单纯扩散、促进扩散、主动运输和基团移位4.设计和配置培养基的原则和方法4个原则：目的明确、营养协调、理化适宜和经济节约4个方法：生态模拟、查阅文献、精心设计和试验比较4.培养基的种类天然培养基、组合培养基和半组合培养基；液体培养基、半固体培养基和固体培养基；基础培养基、选择性培养基和鉴别培养基；复习思考题1.设计表格，比较四种营养物质进入细胞的方式。2.对培养基的种类列表表示。下节课再见了……是指寄生或共生的微生物，Eg.类支原体（MLO）、类立克次氏体（RLO）和少数寄生真菌等。难养菌（fastidiousmicroorganisms）碳氮比（C／N）比：碳源含量氮源含量碳氮比（C／N比）＝碳源中碳原子的摩尔数氮源中氮原子的摩尔数内源调节主要有以下两种方法：第一种是采用磷酸缓冲液进行调节。①pH的内源调节通过培养基内在成分所起的调节作用，就是pH的内源调节。调节K2HPO4和KH2PO4两者浓度比可获得pH6.0～7.6间的一系列稳定的pH。［K2HPO4］［KH2PO4］＝1时，溶液的pH稳定在6.8。反应原理：K2HPO4＋HCl→KH2PO4＋KClKH2PO4＋KOH→K2HPO4＋H2O第二种以CaCO3作“备用碱”进行调节。CaCO3（不溶于水又是沉淀性的，在培养基中分布不均匀）、NaHCO3均可用来调节培养基的pH。反应是：②pH的外源调节这是一类按实际需要不断从外界流加酸或碱液，以调整培养液的方法。水活度定量涵义为：在同温同压下，某溶液的蒸汽压纯水蒸汽压aw＝该溶液的百分相对湿度值（ERH，equilibriumrelativehumidity）aw各种微生物生长繁殖范围的aw值在0.998～0.6之间。back11.天然培养基（complexmedia，undefinedmedia）这是指一些利用动、植物或微生物体或其提取物制成的培养基，这是一类营养成分既复杂又丰富、难以说出其确切化学组成的培养基。例如，培养多种细菌的牛肉膏蛋白胨培养基，培养酵母菌的麦芽汁培养基等。天然培养基的优点：营养丰富、种类多样、配制方便、价格低廉。缺点：是成分不清楚、不稳定，不适宜做精细的科学实验。2.组合培养基（chemicaldefinedmedia）又称合成培养基或综合培养基（syntheticmedia），是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。例如，培养细菌的葡萄糖铵盐培养基，培养放线菌的淀粉硝酸盐培养基（即高氏一号培养基），培养真菌的蔗糖硝酸盐培养基（即察氏培养基）等。组合培养基的优点：成分精确、重演性高。缺点：价格较贵、配制较烦，且微生物生长比较一般。3.半组合培养基（semi-definedmedia）又称半合成培养基（semi-syntheticmedia），指一类主要以化学试剂配制，同时还加有某种或某些天然成分的培养基。例如，培养真菌的马铃薯蔗糖培养基等。1.液体培养基（liquidmedia）一类呈液体状态的培养基，在实验室和生产实践中用途广泛，尤其适用于大规模的培养微生物。2.固体培养基（solidmedia）广义：一类外观呈固体状态的培养基。狭义：在液体培养基中加入凝固剂，使之成为固体的培养基。固体培养基为微生物生长提供一个营养表面，微生物在这表面上可以形成单个菌落。（1）固化培养基（solidifiedmedium）（2）非可逆性固化培养基（3）天然固态培养基（4）滤膜（membranefilter）根据固体的性质又可把它分为4种类型：固