第三章酶的生产

退出EnzymeEngineering酶工程退出第三章酶的生产制备酶的生产方式1.提取法:植物、动物、微生物2.化学合成法退出退出生物合成法：利用植物、动物、微生物细胞合成。上个世纪50年代起利用微生物生产酶。1949年细菌发酵生产淀粉酶上个世纪70年代以来利用植物细胞和动物细胞培养技术生产酶。木瓜细胞培养生产木瓜蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶人黑色素瘤细胞培养生产血纤维蛋白溶酶原激活剂退出动植物细胞培养的特殊性：1、细胞比微生物细胞大得多，体积大几千倍，2、对剪切力敏感，动物细胞没有细胞壁更甚3、生长速率比微生物低，生长倍增时间和发酵周期均更长，4、对营养的要求较微生物复杂，动物细胞往往需要添加血清和其他营养成分退出3、酶的发酵生产经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞的生命活动，产生人们所需要的酶的过程，称为酶的发酵生产。退出第一节酶的生产菌种一、生产菌种1.细菌芽孢杆菌（蜡状、枯草、地衣）、大肠杆菌2.霉菌黑曲霉、米曲霉、木酶3.酵母菌啤酒酵母、假丝酵母4.放线菌链霉菌退出退出退出二、产酶菌种的要求（1）不是致病菌及产生有毒物质或其他生理活生物质的微生物，确保酶生产和应用的安全。（2）能在便宜的底物上生长良好，繁殖快，产酶量高，有利于缩短生周期（3）产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体侵袭。（4）目标酶的产量要高，性能符合应用需要，产生的酶容易分离纯化，最好为胞外酶。（5）除蛋白酶生产菌种外，其他产酶菌种的产蛋白酶活力应该很低，防止目标酶的水解。三.产酶微生物的分离和筛选1)样品的采集:从富含该酶作用底物的场所采集样品2)富集培养:投其所好，取其所抗3)分离获得微生物的纯培养（pureculture）。4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。-淀粉酶的筛选蛋白酶产生菌的获得方法应用含酪蛋白的培养基退出第二节酶的发酵技术一、培养基C/N:产酶促进剂:诱导物表面活性剂二、发酵条件对产酶的影响温度、pH值、通风量退出三、发酵方法1、固体培养发酵：培养基以麸皮、米糠等为主要原料加入其它营养成分，经灭菌、接产酶菌株，在一定条件下发酵，目的获得淀粉酶和蛋白酶，如酒曲生产。2、液体深层发酵液体培养基，在发酵容器中，经灭菌、冷却接入产酶细胞，在一定条件下发酵，是目前酶生产的主要方法。3、固定化细胞发酵退出第三节提高酶产量的方法一、酶合成的调节机制1.操纵子调节基因：阻遏蛋白辅阻遏物退出2、诱导和阻遏诱导：诱导物的加入后，酶才大量合成，参与分解代谢的酶：淀粉酶、纤维素酶阻遏：末端代谢物阻遏：反馈阻遏，合成代谢中的关键酶分解代谢物阻遏：1.酶合成的诱导加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。酶合成诱导的现象：已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶；-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；（2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；（3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。调节基因操纵基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA阻遏蛋白（有活性）基因关闭启动子ORPLacZLacYLaca调节基因操纵基因乳糖结构基因启动子ORmRNAZmRNAYmRNAa阻遏蛋白（无活性）基因表达mRNAA、乳糖操纵子的结构B、乳糖酶的诱导乳糖阻遏蛋白（有活性）诱导2.末端产物阻遏由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。酶合成阻遏的现象：实验：（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。色氨酸操纵子——酶的阻遏调节基因操纵基因结构基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达调节基因操纵基因结构基因辅阻遏物代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化,与操纵基因结合，结构基因不能表达酶的诱导和阻遏操纵子模型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂操纵基因启动基因调节基因结构基因阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表达诱导物诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操纵基因结合,结构基因可以表达阻遏蛋白(无活性)酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达代谢产物3.分解代谢物阻遏指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。分解代谢物阻遏现象：实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie或biphasicgrowth）。02468020406080细胞浓度(OD)时间(h)这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称降解物基因活化蛋白（CAP）。分解代谢物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表达CAP基因结构基因TCAPOCAP结合部位RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代谢产物腺苷酸环化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物与cAMP的关系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）降低cAMP浓度使CAP呈失活状态三、提高酶产量的策略（一）菌种选育（一劳永逸）1.诱变育种(1)使诱导型变为组成型——选育组成型突变株(2)使阻遏型变为去阻遏型选育营养缺陷型突变株•解除反馈阻遏选育结构类似物抗性突变株•解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株2.基因工程育种二、提高酶产量的策略（一）菌种选育（一劳永逸）1.诱变育种(1)使诱导型变为组成型——选育组成型突变株(2)使阻遏型变为去阻遏型选育营养缺陷型突变株•解除反馈阻遏选育结构类似物抗性突变株•解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株2.基因工程育种退出（二）.通过条件控制提高酶产量（1）添加诱导物选择适宜的诱导物及浓度:诱导物：酶的作用底物酶作用底物的前体酶的反应产物酶的底物类似物或底物修饰物等IPTG/乳糖纤维素/纤维二糖诱导纤维素酶退出（2）降低阻遏物浓度避免使用过于丰富的培养基和易被利用的碳源，并设法阻止效应物的形成和浓度的增加。流加和连续培养退出（3）.其他促进分泌：添加表面活性剂离子型对细胞有毒害作用表面活性剂Tween－80非离子型TritonX－100非离子型增加细胞通性，添加产酶促进剂植酸钙镁，聚乙烯醇等退出第四节酶发酵动力学细胞生长速度产物生成速度基质消耗速度环境因素的影响细胞生长动力学发酵产酶动力学发酵动力学研究内容：退出一、酶生物合成的模式微生物细胞的生长历程退出按细胞生长和酶产生的关系，酶生物合成具有下列四种模式：1、同步合成型2、延续合成型3、中期合成型4、滞后合成型1.生长偶联型（又称同步合成型）酶的生物合成与细胞生长同步。特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。a酶细胞细胞或酶浓度时间2.生长偶联型中的特殊形式——中期合成型酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。所对应的mRNA是不稳定的。02468100.00.10.20.30.40.5细胞浓度酶浓度细胞浓度(OD500)酶浓度(U/mL)时间(h)枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线3.部分生长偶联型（又称延续合成型）酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。所对应的mRNA相当稳定。b酶细胞细胞或酶浓度时间040801200204060细胞浓度酶浓度酶浓度(单位/ml)时间(h)0.012.525.037.550.0细胞浓度(g/L)黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线4.非生长偶联型（又称滞后合成型）只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。特点：受分解代谢物的阻遏作用。所对应的mRNA稳定性高。c酶细胞细胞或酶浓度时间02040608001020304050酶浓度细胞浓度细胞浓度(g/L)时间(h)01020304050酶浓度(U)黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线总结：影响酶生物合成模式的主要因素1）mRNA的稳定性2）培养基中阻遏物的存在高可在细胞停止生长后继续合成酶差随着细胞停止生长而终止酶的合成不受阻遏随着细胞的生长而开始酶的合成。受阻遏差细胞生长一段时间或平衡期后，酶才开始合成退出退出mRNA的稳定性，培养基中诱导物，反馈阻遏物，分解代谢物的存在是影响酶生物合成模型的主要因素。mRNA稳定性代谢调节产物生成模型同步合成型(-)诱导dP/dt=α·dX/dt延续合成型(+)诱导dP/dt=α·dX/dt＋β·X中期合成型(-)反馈阻遏dP/dt=α·dX/dt（解除阻遏后）滞后合成型(+)分解代谢物阻遏dP/dt=β·X酶生产中最理想的合成模式：延续合成型（部分偶联）：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。对于：同步合成型：提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵温度。滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。中期合成型：要在提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方面努力。退出目的：提高产酶率和缩短发酵周期最理想的合成模式：延续合成型策略措施：①菌种选育：提高mRNA的稳定性，解除分解代谢物阻遏和反馈阻遏。②发酵代谢调节：理想诱导物的添加，解除反馈阻遏和分解代谢物阻遏（难利用的碳氮源的使用，补料发酵）。③降低产酶温度。退出二、细胞生长动力学微生物细胞生长的动力学方程：退出Monod方程：S－限制性基质浓度；μm—最大比生长速率；Ks—Monod常数退出倒数形式：退出三、产酶动力学产酶动力学方程：X——细胞浓度，以每升发酵液所含的干细胞重量表示（gDC/L）退出固定化微生物细胞发酵产酶一、固定化细胞发酵产酶的特点1、提高产酶率2、可以反复使用或连续使用较长时间3、基因工程菌的质粒稳定，不易丢失4、发酵稳定性好5、缩短发酵周期，提高设备利用率6、产品容易分离纯化7、适用于胞外酶等胞外产物的生产退出第三章酶的生产和制备第五节酶的分离纯化（酶的制备）酶的提取和分离纯化：将酶从细胞或培养基中抽提出来，获得与使用目的相适应的有一定纯度和浓度的酶产品的过程。退出两个基本环节：分离和纯化分离：将酶从原料中抽提出来，并尽可能少引入杂质，得到粗酶液纯化：将酶和杂质中分离开来，或者有选择地将酶从包含杂质中分离出来，得到一定纯度的酶。退出酶的纯化过程与一般蛋白质纯化过程相比的特点：1、特定的一种酶在细胞中的含量较少，2、酶可以通过测定活力的方法加以跟踪。前者给纯化带来了困难，而后者却迅速找出纯化过程的关键所在。理想的提取和分离纯化方法：在提高酶的比活的同时，要求酶回收率高，提取步骤少、工艺简单，成本低退出一、原则1.防止酶失活这一原则要贯穿纯化工作的始终，在后期尤为重要。建立一个可靠和快速、易行的测定酶活方法物理因素、化学因素和生物因素导致酶失活2.分离纯化的环节的选择（经济、宜行）：纯化倍数、酶活回收率和重现性（衡量优劣）经济、可靠，建立灵敏、快速、特异、精确的检测