透明质酸生产工艺概论-姬跃莹

•透明质酸发酵工艺原理综述•姬跃莹200900606030•生化系生物工程091广西科技大学（筹）•摘要：生物发酵法是生产透明质酸的主要方法，分离纯化是发酵法制备高分子量、高纯度透明质酸的关键环节本文探讨了透明质酸发酵液的特性和分离纯化过程中工艺条件对透明质酸分子量和结构的影响，对预处理、分离、纯化各阶段的工艺方法进行了系统比较和分析，指出了透明质酸分离纯化工艺中存在的问题。并提出了今后分离纯化研究的重点。•关键词：透明质酸；分离；纯化•AbstractFermentationhasbecomeaprimarymethodforproducinghyaluronicacid．Separationandpurificationarekeystepsoffermentationinpreparinghighrelativemolecularweight(Mr)andhighpurityhyaluronicacid．ThisarticlediscussesthecharacteristicsoffermentationbrothandtheinfluencesofprocessconditionsonhyaluronicacidMrandstructure，systematicallyanalyzesthetechniquesinpretreatment，separationandpurificationstages．Italsopointsoutsomeexistingproblemsintheseparationandpurificationtechniquesandpresentsthefocusoffutureresearch．•Keywords：hyaluronicacid；separation；purification前言透明质酸,Hyaluronicacid,常常简写为HA,又称玻璃酸,，是一种广泛存在于结缔组织（如动物的皮肤、脐带、关节滑液、软骨、眼玻璃体、鸡冠、鸡胚、卵细胞和血管壁中）及某些微生物荚膜中．具有特殊功能的胞外大分子酸性粘多糖。HA是由(1→4)202D2葡糖醛酸2B2(1→3)2D2N2乙酰葡糖胺的双糖单位重复连接构成的线性多糖。不同动物组织和细菌来源的HA无种属差异,由不同精制方法获得的HA,相对分子质量不同,但也无种属差异。透明质酸(Hyaluronicacid简称HA)分子式透明质酸(Hyaluronicacid简称HA)或称醣醛酸化学方程式示意图该物质在1934年首次从牛眼玻璃体中分离出来。HA水溶液所形成凝胶的独特网状结构和分子内羟基氢键使其具有极好的保水性和流变特性，因而被广泛应用于医学、化妆品等领域。近年来，国际市场对药用级HA的需求增长很快，而药用级HA要求较高的纯度和分子量。但目前国内生产HA的20余家企业中，产品能达到药用级要求的并不多。制备HA的方法主要包括从动物组织中分离提取法和微生物发酵法两种，发酵法生产HA由于原料来源丰富、成本低、易形成规模化生产、易获得高分子量HA等特点，正逐步取代从动物组织中分离提取HA的传统方法。1.发酵机制•1.1生产菌种•1.2生物合成途径•1.3代谢调节机制•1.4产物积累机制1.1生产菌种兽疫链球菌（Streptococcuszooepidemicus）该菌在用于生产时有多种变异版本，如兽疫链球菌NW-162，兽疫链球菌ATCC39920等。1.2生物合成途径链球菌属的多种细菌具有荚膜（如兽疫链球菌），这种荚膜的主要成分就是透明质酸。发酵法生产透明质酸就是利用兽疫链球菌在生长繁殖过程中，向胞外分泌以HA为主要成分的荚膜，再处理发酵液（分离纯化）而得到高纯度的优质的透明质酸。•HA在细胞内的合成是一个复杂的过程,有多种酶的参与,包括己糖激酶、葡萄糖磷酸变位酶、尿苷二磷酸(UDP)2葡萄糖焦磷酸化酶、UDP2葡萄糖脱氢酶、磷酸葡萄糖异构酶、氨基转移酶、乙酰基转移酶、变位酶和UDP2N2乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶等。其中HAS是HA合成途径中的关键酶。HAS包含7个结构区域,即2个UDP2底物结合部位、2个HA2单糖2UDP供给部位、2个糖基转移酶催化位点和1个协助HA糖链跨膜的结构域。其中,2个糖基转移酶催化位点分别具有将UDP2GlcUA和UDP2GlcNAc连入HA糖链还原端的活性。合成HA的过程中,糖链还原端的最后一个单糖残基携带UDP基团,并结合在这种底物单糖的HA2单糖2UDP结合部位上;在相应的糖基转移酶催化位点上,底物结合位点上的UDP2单糖以共价键形式与糖链末端单糖连接,并将原糖链还原端的UDP基团释放。还原端UDP2单糖残基已经改变的糖链进行移位,运动到另外一个HA2单糖2UDP供给部位;然后另一个UDP2底物结合部位和相应的UDP2单糖转移酶催化位点发挥活性,连入新UDP2单糖,糖链再变换HA2单糖2UDP供给部位;依次循环,不断地将UDP2GlcNAc和UDP2GlcUA连入糖链的还原端,延长糖链。每合成二糖单位1moL,消耗腺苷三磷酸(ATP)5moL、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)2moL和乙酰辅酶A1moL。在游离糖链还原端不断延长的同时,糖链被挤压到细胞膜外侧,HA糖链合成到一定长度,还原端与HAS分离,分泌到胞外或细菌荚膜中。1.3代谢调节机制•HA在细胞内的合成是一个复杂的过程,有多种酶的参与,包括己糖激酶、葡萄糖磷酸变位酶、尿苷二磷酸(UDP)2葡萄糖焦磷酸化酶、UDP2葡萄糖脱氢酶、磷酸葡萄糖异构酶、氨基转移酶、乙酰基转移酶、变位酶和UDP2N2乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶等。其中透明质酸合酶(hyaluronicacidsynthase,HAS)是HA合成途径中的关键酶。1.4产物积累机制发酵过程中溶解氧控制在30%饱和度左右时,代谢副产物积累量较少,有利细胞生长和代谢产物HA的积累,而且也最为经济;􀀁有氧发酵的葡萄糖能量代谢可产生更多的ATP，有利于UTP生成，而UTP是生成透明质酸的两个活化前体物，即UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡糖所必需的物质。因此从代谢调控的角度来说，有氧发酵有利于透明质酸的合成。•在HA高密度发酵过程中0~30h调pH7.2,发酵后期调pH6.8。通过采用不同发酵阶段调节pH值,前中期有利于菌种的生长繁殖,后期有利于目的产物的积累（在游离糖链还原端不断延长的同时,糖链被挤压到细胞膜外侧,HA糖链合成到一定长度,还原端与HAS分离,分泌到胞外或细菌荚中），并且减少代谢副产物产生;2.发酵过程控制•2.1发酵工艺流程•2.2发酵控制要点2.1发酵工艺流程斜面种子→摇瓶种子→接种→发酵培养→补料→放罐→发酵液（加乙醇粗提）→粗提液（加助滤剂、活性炭，调pH）→过滤（去除杂质）→滤液（乙醇沉淀）→沉淀物（脱水干燥）→成品透明质酸2.2发酵控制要点2.2.1发酵过程中溶解氧(DO)的控制发酵液中溶氧低于临界溶氧30%时,无氧呼吸造成发酵液中乙酸、乙醇含量增高,pH值降低,抑制细胞生长和产物表达;当溶氧高于临界溶氧30%时,细胞的耗氧速度基本保持不变,但增加生产成本。所以DO控制在30%饱和度时,有利于细胞生长和HA的积累。2.2.2发酵过程中pH的控制由于菌体在生长过程中产酸使pH迅速下降,改变菌体的生存环境,使细胞生物量增长迅速下降。如果在适当的时间调整pH,使其利于菌体的繁殖,那么就可能延长对数生长期,提高HA产量。当培养基起始值为7.2时,菌体生长最好,故最适pH值为7.2,而积累最适pH值为6.8。所以在发酵条件基本不变情况下,在发酵前期4~10hpH7.2,有利于菌体繁殖。当菌体培养到10~30h的发酵中期,菌体增加速率下降,生物量转入正常代谢,耗糖速率加快,HA生成迅速增加,耗氧速率加快,如果pH过低,抑制菌体生长,糖代谢缓慢,发酵时间延长,所以调pH7.2。在发酵产酸期,菌体完成由增殖型向生产型转化,随着时间的延长,糖已耗尽,产酸增加,pH维持6.8,恒温培养36h,有利于大量积累HA,降低乙酸等有害物质的积累。3.产物分离纯化•3.1工艺流程•3.2工艺要点说明3.1工艺流程总体上分离纯化工艺过程可以概括为如下流程：发酵液一预处理一分离(初步纯化)一纯化一干燥一成品。3.2工艺要点说明•3.2.1预处理预处理是在分离纯化前对发酵液进行灭酶、灭菌、除菌的工艺。对于一些非透明质酸酶缺陷型菌株发酵所得的发酵液，通过预处理可以杀灭透明质酸酶，减少HA分子量的降低。杀灭发酵液中的菌体通常加入杀菌剂，常用的杀菌剂包括三氯乙酸、氯仿等。三氯乙酸可以溶解细胞上的脂类物质，使细胞破坏，从而起到灭菌和抑制酶活力的作用。氯仿和三氯乙酸的作用类似，能够使HA逐渐从细胞膜上脱落，使蛋白质变性沉淀，并能渗入细胞膜，除去细菌内毒素等致炎物质，使HA产品安全性提高。而采用加热进行灭菌，灭菌温度一般为75~80℃。采用过滤法除去菌体，使用硅藻土作吸附剂时的滤液浊度和终滤液HA收率优于活性炭。在HA发酵结束后，发酵液经灭菌，再将发酵液加入工业乙醇得到HA粗品沉淀，以20g／L的浓度溶于去离子水，加入硅藻土，充分搅拌以吸附菌体杂质，在pH值4．6～4．8的条件下过滤，滤液在pH值为4．8时浊度最小，在pH值为4．6时蛋白含量最低，蛋白含量和浊度变化趋势随pH值改变基本一致。过滤法除菌体是物理过程，操作简便，效果明显，并且容易在工业化生产中应用。3.2.2分离工艺3.2.2.1乙醇分离除去发酵液中的菌体后，需要将HA分离出来，这是一个初步纯化的过程。乙醇沉淀是分离各种多糖常用的一种方法，可以使HA有效脱水、脱色，从而提高HA产品品质。为了使HA完全沉淀，溶液中应有足够的离子强度，常加入浓度为l％左右的NaCl或NaAc以达到适宜的离子强度。乙醇添加量一般为发酵液体积的2倍。如果乙醇添加量足够大，HA浓度低至0．1％也可沉淀完全。HA溶液具有较高的黏度，乙醇沉淀时如果HA浓度过高，沉淀趋向于糖浆状而难以分离；如果浓度过低，所需乙醇量偏大，不利于降低成本。预处理时由于发酵液黏度较高，离心或过滤前往往要对发酵液进行稀释，HA常因稀释而浓度较低，直接采用乙醇沉淀会消耗大量乙醇，而浓缩可以减少乙醇用量。3.2.2.2膜技术分离•膜技术不仅可以用于发酵液的浓缩，将其作为一种主体技术分离、提纯发酵液中的HA也有一定可行性。采用PVDF材质的膜，对HA发酵液进行错流微滤和超滤，HA浓度在一定的范围内(微滤≤1．2g／L，超滤≤1．5g／L)，膜工艺可稳定地运行。3.2.3纯化工艺•3.2.3.1季铵盐纯化氯化十六烷基吡啶(CPC)是一种季铵盐类阳离子表面活性剂，它能与黏多糖分子中的聚阴离子形成络合物，此络合物在低浓度盐溶液中产生沉淀，而在高浓度的盐溶液中逐渐解离，引起HA与CPC复合物解离所需的盐浓度远比其它黏多糖与CPC复合物解离所需浓度要低，利用此性质可达到纯化HA的目的。向HA粗品溶液中加入等体积的质量分数为4％的CPC溶液，形成絮状物后静置lh，再离心分离，沉淀溶于1．5mol／L的NaCI溶液中，离心除去不溶物。将乙醇沉淀得到的HA粗品溶于0．05mol／L的NaCl溶液中，加入l％CPC，搅拌30min后静置lh，离心收集沉淀后溶于不同浓度NaCl溶液中，发现NaCl溶液浓度为0．35mol／L时HA纯度和产量较高。将HA粗品溶于0．15mot／LNaCI中得到0．25％的HA溶液，1倍体积10％CPC(溶在0．15mol／LNaCI中)加入8倍体积的0．25％的HA溶液中，通过离心分离CPC沉淀，用0．15mol／LNaC!洗涤，得到较纯的HA溶液。采用CPC进行纯化的优点是操作简单，但CPC回收困难，单位价格较高，所以应用成本较高。•十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)纯化HA的作用机制与CPC相似，但成本相对较低。将初步除去菌体和不溶性杂质的提取液中加入CTAB，通过离心分离沉淀，并用0．15mol／LNaCl洗涤沉淀，浸泡在1．5mol／LNaCI溶液中过夜，CTAB．HA复合物可解离溶解，最