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©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL培训教程(方法转换)©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL2方法转换考虑因素方法转换考虑因素四种类别的HPLC方法转换包括:—长柱转换为短柱—从一个色谱柱品牌转换到另一个品牌—从一个系统转换为另一个不同的系统—同时转换系统和色谱柱方法转换到UPLC系统且使用UPLC柱时,UPLC的好处才能够完全体现—需要同时转换系统和色谱柱©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL3从从HPLCHPLC转换到转换到UPLCUPLCAbsorbance254nmMinutes02.65.2123Absorbance254nmMinutes0102030132原始30分钟HPLC图转换后5.2分钟UPLC图©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL4实现方法转换实现方法转换:HPLC:HPLC到到UPLCUPLCUPLC将会同时提高速度、灵敏度和分离度详细地描述HPLC方法将会大大简化转换过程系统地转换会得到昀好的结果©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL5关于方法转换的特别提示关于方法转换的特别提示新的UPLC方法可能会与原来的HPLC方法有所不同….—操作条件,比如,流速—运行时间—表现但是,新的UPLC™方法必须达到HPLC方法的目标要求—相关被分析物的完全分离—峰纯度—确切地鉴别峰—定量的准确度和精密度©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL6成功进行方法转换的步骤成功进行方法转换的步骤得到现有方法和结果的信息仪器比较选择新的或是目标色谱柱—色谱柱化学—直径在几何放大的基础上选择目标条件评估转换的结果如需要再进行优化©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL7所需的信息所需的信息::原始方法原始方法色谱柱—色谱柱化学(键合配体,品牌,粒径大小)—柱内径色谱条件—流动相—流速—梯度表:包括再生和再平衡—温度样品—稀释—浓缩—分子量—进样体积©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL8所需的信息所需的信息::原始结果原始结果色谱图—峰数目—保留—分离度定量—检测限—定量限—线性范围—准确度—精密度©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL9成功进行方法转换的步骤成功进行方法转换的步骤得到现有方法和结果的信息仪器比较选择新的或是目标柱—色谱柱化学—直径在几何放大的基础上选择目标条件评估转换的结果如需要再进行优化©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL10梯度与等度梯度与等度等度方法—不同仪器之间的系统体积差异影响较小—可以直接通过几何缩放的形式转换梯度方法—不同仪器之间的系统体积差异对转换影响很大©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL11仪器比较仪器比较::溶剂输送溶剂输送我们假定:—溶剂总是以程序所设定的流速流动—百分比组成总是以设定值变化—梯度按照所设定的梯度表而运行—溶剂组成可以按照所设定的时间达到色谱柱©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL12仪器比较仪器比较::溶剂输送溶剂输送然而,色谱系统的不同会影响:—保留时间—灵敏度—重新平衡的时间©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL13所需的信息所需的信息::原始方法原始方法梯度形成的模式—配有梯度比例阀的单泵—双泵—品牌和型号系统体积(死体积或滞后体积)—值和测量所用方法进样机理检测模式©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL14例例::原始方法原始方法室温:21-22℃流速:1.50mL/min分析样品:咖啡因(100μg/mL)氢化奎尼丁(33μg/mL)3-氨基二苯酮(39μg/mL)分子量:小于500amu样品稀释剂:二甲基亚砜(DMSO)进样体积:10μL检测波长:254nm流动相:A:0.05%TFA水溶液B:0.05%TFA乙腈溶液©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL15例例::原始的梯度表原始的梯度表梯度段时间流速%A%B曲线起始01.5955*6112151.55953201.55954301.5955©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL16例例::原始的色谱柱原始的色谱柱固定相:XTerra®MSC18粒径:5µm内径:4.6mm长度:150mm计算:dp150,000μm5μm==30,000L©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL17例例::原始的仪器原始的仪器WatersAlliance®2695溶剂管理器—低压混合的单泵梯度WatersAlliance®2695样品管理器Waters2487TUV/254nm©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL18例例::原始的结果原始的结果Absorbance254nmMinutes1230102030分离度(1,2)=12分离度(2,3)=28©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL19系统滞后测试结果系统滞后测试结果Alliance®2695=1.04mlACQUITYUPLC™=0.109ml这将会给方法转换带来什么不同吗?—Alliance2695使用4.6x150mm色谱柱—ACQUITYUPLC™使用2.1x50mm色谱柱©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL20成功进行方法转换的步骤成功进行方法转换的步骤得到现有方法和结果的信息仪器比较选择新的或是目标色谱柱—色谱柱化学—直径在几何放大的基础上选择目标条件评估转换的结果如需要再进行优化©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL21目标柱目标柱:ACQUITYUPLC:ACQUITYUPLC柱柱键合相—ACQUITYUPLCBEHC18—ACQUITYUPLCBEHShieldRP18—ACQUITYUPLCBEHC8—ACQUITYUPLCBEHPhenyl查看色谱柱选择性表找到与之前的柱子昀相近的©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL22ACQUITYUPLCACQUITYUPLC柱柱ACQUITYUPLCBEHC18ACQUITYUPLCBEHC8ACQUITYUPLCBEHShieldRP18Waters专利技术(氨基甲酸酯极性基团嵌入)ACQUITYUPLCBEHPhenyl©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL23配体选择性配体选择性紫海胆中的咖啡酸衍生物紫海胆中的咖啡酸衍生物Minutes0.001.002.003.004.005.0012453BEHC18BEHC8BEHShieldRP18BEHPhenyl124531245312453©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL24用来测量残留硅羟基活性的组分用来测量残留硅羟基活性的组分二氢苊(中性组分)的保留取决于填料中化学键合相的疏水性—填料的疏水性越高,保留因子(k)值越高.阿米替林(碱性组分,pka=9.4)的保留取决于两个因素:化学键合相的疏水性和残留硅羟基的活性及浓度(碱性化合物较难分析的一个很好的例子)©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL25反相柱选择性表反相柱选择性表(ln[α]amitriptyline/acenaphthene)第二代杂化颗粒技术允许HPLC方法首先转化为XBridge™柱的方法(基于选择性考虑),然后再有效地转换到UPLC™.(ln[k]acenaphthene)ACQUITYUPLC™BEHXBridge™ShieldRP18YMC-Pack™ODS-A™YMCJ'sphere™ODS–H80ACQUITYUPLC™BEHXBridge™C18SunFire™C18YMC-Pack™PolymerC18™Hypersil®CPSCyanoYMC-Pack™CNWatersSpherisorb®S5PHypersil®BDSPhenylNova-Pak®PhenylYMC-Pack™PhenylHypersil®PhenylInertsil®Ph-3YMC-Pack™ProC4™YMCbasic™Symmetry®C8YMC-Pack™ProC8™Nova-Pak®C8XTerra®MSC18Symmetry®C18YMC-Pack™ProC18™Inertsil®ODS-3Nova-Pak®C18YMCJ'sphere™ODS–L80Nucleosil®C18WatersSpherisorb®ODS2WatersSpherisorb®ODS1Resolve®C18µBondapak™C18YMC-Pack™ODS–AQ™YMCJ'sphere™ODS–M80Inertsil®CN-3WatersSpherisorb®S5CNNova-Pak®CNHPSymmetryShield™RP8SymmetryShield™RP18XTerra®RP8XTerra®RP18-0.6-0.300.30.60.91.21.51.82.12.42.733.33.6-1.5-0.50.51.52.53.5XTerra®MSC8Luna®C18(2)XTerra®PhenylLuna™PhenylHexylChromolithTMRP-18Atlantis®dC18Zorbax®XDBC18ACTAce®C18Zorbax®SBC18SunFire™C8Luna®C8(2)ACQUITYUPLC™BEHXBridge™C8ACQUITYUPLC™BEHXBridge™Phenyl©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL26现代现代““CC1818区域区域””(ln[k]acenaphthene)XTerra®MSC18Hypersil®EliteC18Inertsil®ODS-3Hypersil®HyPurityEliteC18Luna™C18YMC-Pack™ProC18™Zorbax®Eclipse®XDBC18Zorbax®RxC18Prodigy™C18Symmetry®C18SymmetryShield™RP18Supelcosil™LC-ABZ+PlusSupelcosil™LCDB-C18XTerra®RP18Luna™C18(2)Polaris™C18-A-0.200.20.40.60.811.522.533.5(ln[α]amitriptyline/acenaphthene)1.01.2Atlantis®dC18YMC-Pack™ODS–AQ™放大图ACQUITYUPLC™BEHXBridge™C18ChromolithTMRP-18Nucleosil®C181.5SunFire™C8SunFire™C18ACQUITYUPLC™BEHXBridge™ShieldRP18ACQUITYUPLC™BEHXBridge™PhenylACQUITYUP
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