飞行时间质谱仪

生物质谱分析技术主讲：胡水旺南方医科大学病生教研室E-mail:[e-mail]:493448858第一部分系统生物学的发展生命科学研究的目标寻找生命活动的起源及奥秘，解释及探索生命活动的一般规律，改善人类生活质量，延长人类寿命对生命的认识过程1.生命是神造的、上帝造（ByGod）等；2.生命是活力（Activity）；3.生命是机器（Machine）；4.生命是信息（Information）。系统生物学的定义系统生物学（systemsbiology），是在细胞、组织、器官和生物体整体水平多层次、多系统研究各种分子（DNA、mRNA、蛋白质、糖类、脂类等）的结构、功能及其相互作用，用计算生物学方法整合各组学数据来定量描述和预测它们的生物功能、表型和行为的科学。系统生物学不同于以往的实验生物学，仅关心个别的基因和蛋白质，它要研究所有的基因、所有的蛋白质、组分间的所有相互关系。还原论vs整合论传统生物学是还原论(reductionism)的观点还原论假设一个复杂的系统可以分割为许多不会互相干扰的子系统，因此只要将子系统研究清楚，就能了解复杂系统的行为。系统生物学是整合论(synthesis)的观点面对子系统不独立的可能性，希望寻找新的方法来解决子系统间交互作用的问题。组学实验理论计算基因组转录组蛋白质组相互作用组代谢组表型组数据整合模型构建系统干涉合成生物学系统生物学研究的两大技术方法：组学实验和理论计算系统生物学应用举例应用系统生物学的方法可以预测药物的作用机制、病人对药物的应答，包括毒副作用和疗效等。例如，美国纽约基因网络科学公司（GeneNetworkSciences）构建了一种人类癌细胞模型，该模型内含有500多种基因和蛋白质，可将以前分别孤立研究的生物过程联系在一起，利用该生物网络模型，能够更好地理解细胞的生物学行为。第二部分蛋白质组学的兴起解析疾病机制手段的改进:DNAProtein蛋白质表达调控转录水平调控翻译水平调控翻译后水平调控蛋白质存在复杂的翻译后修饰，作为生命功能的行使者，它比基因更能直接地反映生理过程及其变化。蛋白质相互作用及空间构向等问题是生命现象复杂性的真实体现。蛋白质研究的复杂性蛋白质研究的复杂性细胞周期信号转导图传统的蛋白质研究方法中存在的问题1.生命现象的发生往往是多因素的，必然涉及到多个蛋白质。2.多个蛋白质的参与是交织成网络的，或平行发生，或呈级联因果关系。3.在执行生理功能时蛋白质的表现是多样的、动态的，并不像基因组那样基本固定不变。随着人类基因组计划重点由结构基因组到功能基因组的转移，生命科学开始进入后基因组时代。研究基因终产物及生命活动直接功能执行者蛋白质的科学-蛋白质组学（Proteomics）应运而生。蛋白质组最早是由澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams在1994年的意大利举办的双向电泳会议上首次提出来的。Proteome一词由“蛋白质（PROTEin）”与“基因组（genOME）”杂合而成，对于“基因组学（Genomics）”,“蛋白质组学”定义为一个基因组所表达的全套蛋白质。由Proteome进一步派生出Proteomics。2001年，Science杂志把蛋白质组学列为21世纪六大研究热点之一。2003年4月14日，科学家宣布人类基因组计划已经顺利完成，99%的人类遗传密码被破译，人类基因组图谱提前2年完成。蛋白质组学被进一步提上日程。蛋白质组学(Proteomics)：是通过大规模研究蛋白质的表达水平的变化、翻译后修饰、蛋白质与蛋白质之间的相互作用，以获取蛋白质水平上疾病变化、细胞进程及蛋白质网络相互作用的整体综合信息的科学研究。疾病蛋白质组学：蛋白质组学用于研究疾病发病机制便发展为疾病蛋白质组学。蛋白质组学定义蛋白质组学的研究的机遇和挑战：机遇：基因组计划的快速进行，大量基因序列和EST的确定为蛋白质的快速鉴定提供了良好的基础。挑战：从单一蛋白质的研究转变到细胞和组织的整体蛋白质研究，在理论和技术上提出了挑战。蛋白质研究技术的革命：蛋白质组学蛋白质组学常用的两大技术平台第三部分生物质谱技术的原理及应用质谱技术特点质谱仪是一个用来测量单个分子质量的仪器，实际上质谱仪提供的是分子的质量与电荷比(m/zorm/e).质谱法是一强有力的分析技术。它可用于未知化合物的鉴定、定量分析、分子结构及化学特性的确定等方面；所需化合物的量非常低：10-12g,或10-15mole；应用范围广:(1)有机质谱法：生物、医药、聚合物、法医和环境等方面；(2)无机质谱法：地球化学，地质矿产和无机元素分析鉴定等方面。质谱分析原理质谱分析法是通过对被测样品离子的质荷比的测定来进行分析的一种分析方法。被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同，把离子按质荷比（m/z）分开而得到质量图谱，通过样品的质量图谱和相关信息，可以得到样品的定性定量结果。质谱发展史1911年:世界第一台质谱装置（J.J.Thomson）40年代:用于同位素测定和无机元素分析50年代：开始有机物分析（分析石油）60年代：研究GC-MS联用技术70年代：计算机引入生物质谱的发展80年代：快原子轰击电离，基质辅助激光解吸电离，电喷雾电离，大气压化学电离质谱技术因解决科学前沿难题屡次获得诺贝尔奖：1.1906年，Thompson.J.J（发明质谱技术）；2.1922年，AstonF.W（利用质谱仪发现非放射性同位素）；3.1980年，PaulW.（发明离子阱原理与技术）；4.1996年，CurlR.F/SroalleyR.E.等（用质谱仪观测到激光轰击下产生的碳60）；2002年美国科学家约翰.芬恩与日本科学家田中耕一由于发明了对生物大分子的质谱分析方法而获得了诺贝尔化学奖。因为该方法解决了生物大分子“是什么”的问题。质谱仪的示意图数据处理系统离子检测器质量分析器离子源蛋白质产生离子按离子的质量与电荷比分离离子离子转换成电信号控制整个质谱仪高斯状峰棒状峰质谱工作流程进样系统离子源质量分析器离子检测器1.加热进样2.直接进样1.单聚焦2.双聚焦3.飞行时间4.四极杆1.电子轰击2.化学电离3.场致电离4.激光5.快原子轰击质谱的构造进样系统：按电离方式的需要，将样品送入离子源的适当部位，分为加热进样和直接进样。离子源：用来使样品分子电离生成离子质量分析器：利用电磁场的作用将来自离子源的离子束中不同质荷比的离子按空间位置，时间先后或运动轨道稳定与否等形式进行分离离子检测器：用来接受、检测和记录被分离后的离子信号进样系统气体进样液体进样固体进样离子源电子轰击电离（EI）化学电离（CI）快原子轰击（FAB）电喷雾电离（ESI）基质辅助激光解吸电离（MALDI）表面增强激光解吸电离(SELDI)技术1).电子轰击(Electronimpact,EI)电离M+e-M+.+2e-Fi+,i=1,2,3,……….电子束气体分子离子束2).化学电离(chemicalionization,CI)正离子模式：GH++M[M+H]++G负离子模式：[G-H]-+M[M-H]-+GG:离子化的试剂气体分子,CH4,NH3等M:被分析物电子束气体分子试剂分子离子束3).快原子轰击(Fastatombombardment,FAB)离子化技术-可分析分子量达数千的多肽,极性分子.4).电喷雾离子化(Electrosprayionization,ESI)技术a).常规电喷雾源(mL/min)b).微升喷雾源(µL/min)c).毫微喷雾源(nL/min)DryinggasNebulizergas电喷雾离子化（ElectrosprayIonizsation，ESI）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比（m/z）降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出可以方便地与多种分离技术联合使用，如液质联用（LC－MS）是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。5).基质辅助激光解吸电离技术(Matrix-assistedlaserdesorption/ionization,MALDI)离子化过程MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定MALDIMatrix应具有的特性能够嵌入样品分子间并能起到隔离样品分子之间的相互作用(如形成共结晶);能溶解于可溶解样品分子的溶剂;在真空状态下是稳定的;可吸收激光,既与激光形成共振吸收;可激发样品分子离子化.样品引入方式：直接进样优点：a).快速获得分子量的信息;b).快速获得混合肽的肽谱.缺点:a).金属离子干扰,Na,K；b).离子源结构复杂,；c).没有LC/MALDI接口；d).实现MS/MS困难e).需要基质质量范围:分子量小于500,000Da6).表面增强激光解吸电离(Surface-enhancedlaserdesorption/ionization,SELDI)技术addingtheproteinsample,washing,addingtheenergyadsorbingmolecule(EAM)质量分析器磁分析器四极杆质量分析器(Quadrupoleanalyzer)离子阱质量分析器(Iontrapanalyzer)飞行时间质量分析器(Timeofflightanalyzer)傅立叶变换离子回旋共振分析器（Fouriertransformioncyclotronresonanceanalyzer）1).磁质谱仪(magnetic-sectormassspectrometer)•经典质量分析器：带电粒子在磁场中运动受到洛伦兹力的作用m:离子的质量z:离子所带电量V:离子飞行速度B:磁场强度rV2rBzm22MSMS/MS空间串联质谱仪优点：a).高重现性(稳定性);b).最好定性分析工具;c).可以实现高分辨;d).高灵敏度;e).宽的动态范围;f).可以实现多级质谱的串联;g).高能collision-induceddissociation(CID)谱重现性好.缺点:a).不能较好的与脉冲离子化技术联用(如:MALDI);b).造价高,体积大;c).联动扫描MS/MS谱的分辨率低.应用:a).所有的有机质谱分析方法;b).精确质量测量;c).定量分析;d).同位素丰度比的测量.2).四极质量过滤器质谱仪(quadrupolemassfiltermassspectrometer)quadrupoleMathieu方程四级杆质量分析器四极杆分析器由四根棒状电极组成。电极材料是镀金陶瓷或钼合金。相对两根电极间加有电压（Vdc+Vrf），另外两根电极间加有-（Vdc+Vrf）。其中Vdc为直流电压，Vrf为射频电压。四个棒状电极形成一个四极电场。通过改变扫描电压让不同质荷比的离子分离开。优点:a).可获得经典的质谱图;b).重现性好;c).以其体积较小,造价较低;d).在三级四极杆串联质谱分析器上或四极杆分析器与磁质谱(飞行时间)分析器组成的混合串联分析器上可获得低能CID谱;缺点:a).峰强度与峰的质荷比有关;b).分辨率低;c).不能较好地与脉冲离子化技术结合(如:MALDI);d).collision-induceddissociation(CID)MS/MSspectra与collisionenergy,collisiongas,p