1.1-工具酶的发现和基因工程的诞生

思考：什么叫基因？基因、DNA、染色体之间是怎样的关系？什么是遗传信息？如何表达？能否让大肠杆菌产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术——基因工程。第一章基因工程第一节工具酶的发现和基因工程的诞生一、基因工程的概念就是把一种生物的基因转入另一种生物体中，使其产生我们需要的基因产物，或者让它获得新的遗传性状。其核心是构建重组DNA分子。（又称为重组DNA技术）转鱼抗寒基因的番茄思考：大肠杆菌和人是差异很大的两种生物，通过基因重组后，大肠杆菌能够合成人的胰岛素，这说明了什么？能产生人胰岛素的大肠杆菌人和细菌遗传物质(DNA)的化学组成和空间结构相同，且共用一套遗传密码。二、基因工程的诞生理论基础•DNA是遗传物质的发现•DNA双螺旋结构的确立•遗传信息传递方式(中心法则)的认定技术保障转基因抗虫棉的培育基因工程工具的发现和应用•限制性核酸内切酶•DNA连接酶•基因载体(如质粒)——使来自异种生物的DNA拼接成为可能——使基因在异种生物细胞内表达成为可能转基因抗虫棉的培育过程抗虫棉普通棉普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因与运载体DNA拼接导入棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)表达思考思考：如何将苏云金芽孢杆菌细胞内的抗虫基因从它的DNA分子中切割下来？如何将切下来的抗虫基因与运载体DNA连接起来？如何将重组的DNA运送到棉花细胞？需要切割DNA的工具（分子手术刀）需要连接DNA片断的工具（分子缝合针）需要基因转移的工具（分子运输车）——限制性核酸内切酶——DNA连接酶——基因载体工具酶三、基因工程的基本工具1、限制性核酸内切酶（简称限制酶）能够识别和切割DNA分子内一小段特殊核苷酸序列的酶。•含义：主要从原核生物中分离得到•来源：磷酸与脱氧核糖之间的磷酸二酯键•作用部位：有专一性。即一种限制酶只能识别一种特定核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。•作用特点：产生黏性未端•作用结果：已经发现数千种•种类：大肠杆菌中的一种限制性核酸内切酶（EcoRI）能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开•举例：思考EcoRIAAGTTCCTTAAGCTTAAGGAATTC识别GAATTC序列，并在G和A之间切开限制酶在切断DNA时，可在切口处带有几个伸出的核苷酸，他们之间碱基正好互补配对，因此称这些片断为黏性末端。思考：要想获得某个特定性状的基因必须要用限制性核酸内切酶切几个切口？可产生几个黏性末端？切两个切口，产生四个黏性末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端。如果让两者的黏性末端通过氢键连接起来，是否就可以形成重组的DNA分子了？CGGCCGTATAATATGCGCGCTAATCGTATAATATGCTATAEcoRIEcoRICGGCCGTTAAAATTGCGCGCTAATCGTTAAAATTGCTATACGGCCGTTAAAATTGCTATA三、基因工程的基本工具2、DNA连接酶两条链的骨架部分，形成磷酸二酯键•连接部位：具有相同黏性末端的两个DNA片段连接起来，形成重组DNA分子。•结果：•限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键，只是一个是切开，一个是连接•注意：CGGCCGTTAAAATTGCTATA思考•氢键的断裂与形成与限制酶、DNA连接酶无关。思考：用DNA连接酶连接两个相同的黏性未端要形成几个磷酸二酯键？2个用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键？4个外源基因（如抗虫基因）怎样才能运送到受体细胞（如棉花细胞）？需要“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体三、基因工程的基本工具3、基因载体（运载体）作为运载工具，将外源基因送入受体细胞。•作用：•条件：⑴能在宿主细胞内自我复制并稳定地保存⑵有一个或多个限制酶切点，可使外源基因插入其中⑶具有某些遗传标记基因，以便进行筛选⑷对受体细胞无害质粒（最常用）、噬菌体和某些动植物病毒•种类：思考：假如外源基因导入受体细胞后不能复制会怎样？作为载体如果没有限制酶切割位点将怎样？外源基因是否进入受体细胞，你如何去察觉？如果载体对受体细胞有害将怎样？会在细胞增殖中丢失外源的基因不可能插入如果载体上有遗传标记基因，就可通过标记基因的表达来检测。将影响受体细胞新陈代谢，进而使转入的外源基因也可能无法表达。质粒细菌及酵母菌等。最常用的是大肠杆菌的质粒。•来源：•本质：•特点：染色体外的小型双链环状DNA分子。•能自我复制；•常具有抗生素抗性基因(标记基因)；•其存在对宿主细胞无影响。可以检测质粒是否导入了受体细胞思考：质粒上存在的标记基因有什么用途？要想将某个特定基因与质粒相连，需要用几种限制性核酸内切酶处理？1种四、基因工程的诞生时间：•1972年，斯坦福大学合成第一个人工DNA重组产物•1973年，斯坦福大学实现了细菌之间的性状转移——标志基因工程的诞生20世纪70年代•不同生物的DNA能拼接在一起基因工程的成功能说明哪些问题？小结说明所有生物的DNA都具有相同的化学组成(四种脱氧核苷酸)和空间结构(双螺旋结构)•一种生物的基因能够在另一种生物体内表达说明基因是有遗传效应的DNA片段，具有一定的独立性，同时也说明各种生物共用一套遗传密码小结：•基因工程诞生于。•基因工程诞生的理论基础：。•基因工程创建的技术保障：。其中限制性核酸内切酶和DNA连接酶为提供了必要的手段，而载体，达到了基因工程的目的。练习练习：1、科学家们经过多年努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程，实施该工程的最终目的是A.定向提取生物体的DNA分子B.定向地对DNA分子进行“剪切”C.在生物体外对DNA分子进行改造D.定向地改造生物的遗传性状【答案：D】2、以下说法正确的是A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、基因控制的性状都能在后代表现出来【答案：C】练习：4、基因工程又叫重组DNA技术。假设以大肠杆菌质粒作为基因载体，并以同一种限制性核酸内切酶切割载体与目的基因，将切割后的载体与目的基因片段混合，并加入DNA连接酶。连接产物至少有种环状DNA分子(假设两两结合)，它们分别是：3运载体与运载体相连、目的基因与目的基因相连、运载体与目的基因相连3、人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性B.有利于对目的基因是否导入受体细胞进行检测C.增加质粒分子的分子量D.便于与外源基因连接【答案：B】5、下图是将人的生长激素基因导入B细胞内制造“工程菌”示意图，所用载体为质粒A。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因，质粒A导入细菌B后，其上的基因能得到表达。请回答下列问题：(1)若把通过鉴定证明导入了普通质粒A或重组质粒的细菌放在含有氨苄青霉素的培养基上培养，会发生的现象是：其原理是：(2)导入B细胞中的目的基因成功表达的标志是：有的能生长,有的不能生长普通质粒含氨苄青霉素基因；重组质粒氨苄青霉素基因被破坏。能合成人的生长激素6、限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。①请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。②请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。③在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接起来？为什么？能。因为由两种限制性切割后所形成的黏性末端是相同的。有关DNA酶将两个DNA片段通过磷酸二酯键连接。•DNA水解酶：•DNA解旋酶：•限制性核酸内切酶：•DNA聚合酶：•DNA连接酶：将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解时生成磷酸、脱氧核糖和含氮碱基。使DNA解旋成单链，作用部位是碱基与碱基之间的氢键。（在适当的高温、重金属盐的作用下，也可使DNA解旋）以一条DNA链为模板，将单个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接成互补DNA链。将DNA切成片断，作用部位是磷酸二酯键。