NGS系列讲座——NGS基本原理

NGS系列讲座（一）——NGS简介及原理2017/06/01魏冬凯Outline二代测序技术背景Solexa测序原理Outline二代测序技术背景Solexa测序原理其他平台测序技术简介什么是DNA测序？测序的研究对象是什么？DNA测序（DNAsequencing，或译DNA定序）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。——百度百科测序主要研究的是DNA一级结构，不涉及DNA的二级、三级结构DNA合成的基本过程dNTPddNTP一代测序末端终止法（ABI3700）使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用荧光染料标记4种不同的碱基，通过计算机自动读出。Frederick“Fred”SangerSanger测序5’TGCGCGGCCCAPrimerACGCGCCGGGT???????????????5’3’Sanger测序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’5’TGCGCGGCCCAPrimerGTCTTGGGCTSanger测序GTCTTGGGCTAGCGCACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’5’TGCGCGGCCCAPrimerGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bpSanger测序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’GTCTTGGGCTAGCGC5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCAPrimerGTCTTGGGCTASanger测序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’GTCTTGGGCTAGCGC5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA22bp5’TGCGCGGCCCAPrimerGSanger测序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’GTCTTGGGCTAGCGC5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA22bp5’TGCGCGGCCCAG12bp5’TGCGCGGCCCAPrimerGTCTTGGGCSanger测序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’GTCTTGGGCTAGCGC5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA22bp5’TGCGCGGCCCAG12bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGC20bp5’TGCGCGGCCCAPrimerGTCTTSanger测序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’GTCTTGGGCTAGCGC5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA22bp5’TGCGCGGCCCAG12bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGC20bp5’TGCGCGGCCCAGTCTT16bpSanger测序ACGCGCCGGGT???????????????5’3’??????????????C5’TGCGCGGCCCA?????????T5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCA??????????A22bp5’TGCGCGGCCCAG12bp5’TGCGCGGCCCA????????C20bp5’TGCGCGGCCCA????T16bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGG19bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA22bpSanger测序GTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGC20bp5’TGCGCGGCCCAG12bp5’TGCGCGGCCCAGT13bp5’TGCGCGGCCCAGTCTT16bp5’TGCGCGGCCCAGTC14bp5’TGCGCGGCCCAGTCT15bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTG17bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGG18bpLaserReaderSanger测序Sanger测序的特点测序长度500-1000bp。通量低，每次测序最多获得1kb数据，如果测大基因组，成本极高。错误率高，PCR带来错配。测序基于PCR反应，需要引物，并且有些些结构复杂的难于进行PCR反应的片段不能测序。1990年10月美国确定把当年的10月1日作为官方实施HGP的起始日期，被誉为生命科学“阿波罗登月计划”的国际人类基因组计划启动。2000年完成草图，2003年正式完成。全部人类基因组约有2.91Gbp，约有39000多个基因。目前已经发现和定位了26000多个功能基因。耗时13年，30亿美金。人类基因组计划（HGP）1977年Roche454IlluminaGAABIsolidHelicos单分子测序仪Pacific单分子测序仪第一代第二代第三代二代测序技术的出现鸟枪法基因组基因组片段鸟枪法基因组片段通过剪切力，超声，酶切等打断基因组ATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGTTCCACCGTGTTTTCCGACCGTTTCCGACCGAAATGGCTTGTTCCCACAGACCGTGAGCTCGATGCCGGCGAAGATGCCGGCGAAGCATTGTTAATGCGACCTCGATGCCACAGACCGTGTTTCCCGAAAGCATTGTTCCCACAGTGTTTTCCGACCGAAATCCGACCGAAATGGCTCCTGCCGGCGAAGCCTTGT17bp66bp基本测序思路ATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGTTCCACCGTGTTTTCCGACCGTTTCCGACCGAAATGGCTTGTTCCCACAGACCGTGAGCTCGATGCCGGCGAAGATGCCGGCGAAGCATTGTTAATGCGACCTCGATGCCACAGACCGTGTTTCCCGAAAGCATTGTTCCCACAGTGTTTTCCGACCGAAATCCGACCGAAATGGCTCCTGCCGGCGAAGCCTTGTTAATGCGACCTCGATGCCGGCGAAGCATTGTTCCCACAGACCGTGTTTTCCGACCGAAATGGCTCC基因组:基本测序思路ATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGTTCCACCGTGTTTTCCGACCGTTTCCGACCGAAATGGCTTGTTCCCACAGACCGTGAGCTCGATGCCGGCGAAGATGCCGGCGAAGCATTGTTAATGCGACCTCGATGCCACAGACCGTGTTTCCCGAAAGCATTGTTCCCACAGTGTTTTCCGACCGAAATCCGACCGAAATGGCTCCTGCCGGCGAAGCCTTGTTAATGCGACCTCGATGCCGGCGAAGCATTGTTCCCACAGACCGTGTTTTCCGACCGAAATGGCTCC基因组:基本测序思路Outline二代测序技术背景Solexa测序原理其他二代测序平台技术简介Solexa测序的关键技术（Illumina）桥式PCR(Solid-phasebridgeamplification)OPPPHNNOO荧光基团3’保护基团Nextcycle掺入检测去保护基团去荧光基团ODNAHNNOO3’O5’游离3‘末端XOH•4种标记过的核苷酸可逆终止反应ReversibleTerminatorChemistrySolexa测序的关键技术（Illumina）桥式PCR准备DNA片段两端接上adapters桥式PCR准备DNA片段两端接上adapters将DNA片段通过adapter锚定在芯片上循环扩增DNA片段成“DNA簇”20micronsSequence桥式PCRCAGTCATCACCTAGCGTA5’GTCAGTCAGTCAGT3’5’FirstbaseincorporatedCycle1:AddsequencingreagentsDetectSignalCleaveTerminatorandDyeCycle2-n:Addsequencingreagentsandrepeat边合成边测序(SequencingBySynthesis)SBS123789456TTTTTTTGT…TGCTACGAT…根据每个DNA簇每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相应的DNA序列Solexa测序原理测序种类Single-ReadSequencing(SR)测序种类Single-ReadSequencing(SR)Paired-EndSequencing(PE)测序种类Single-ReadSequencing(SR)Paired-EndSequencing(PE)测序种类Single-ReadSequencing(SR)Paired-EndSequencing(PE)IndexSequencing(PE)测序种类Single-ReadSequencing(SR)Paired-EndSequencing(PE)IndexSequencing(PE)测序种类Single-ReadSequencing(SR)Paired-EndSequencing(PE)IndexSequencing(PE)√Question谢谢！