第二章3-4节

生物制药工艺学焦飞Tel：18298856480E-mail：[e-mail]第二章次级代谢产物的生物合成与调控第一节微生物的代谢产物第二节次级代谢产物的构建单位与合成途径第三节次级代谢产物的生物合成过程第四节次级代谢产物生物合成的调控主要包含以下几步：1）养分的摄入；2）通过中枢代谢途径养分转化为中间体；3）小分子建筑单位（次级代谢物合成的前体）的生物合成；4）如有必要，改变其中的一些中间体；5）这些前体进入次级代谢物生物合成的专有途径；6）在次级代谢的主要骨架形成后做最后的修饰，形成产物。第三节次级代谢产物的生物合成过程（一）构建单位的聚合如柱晶白霉素由5个乙酰单位，1个丙酸单位，1个丁酸单位，1个羟基乙酰单位经聚酮体途径缩合而成。构成次级代谢产物的构建单位的种类和数量是不同的，有的由单一前体构成，绝大多数品种由两种以上的构建单位组成。新生霉素来自酪氨酸（二）次级代谢产物的最终修饰四环素土霉素脱氢四环素－C4氧化反应及氨化反应C6羟化反应C4-NH2甲基化反应四环素环－四环素环－C7氯化反应－金霉素OHOHN(CH3)2OHCONH2OOR1R3R2R4OHHH12345678910111211a12a（三）产物合成后的修饰次级代谢产物由几部分连接后，往往还不具有生物活性，还要经过后修饰过程才能产生具有生物活性的代谢产物。这些后修饰过程包括：氨基化、甲基化、酰基化、羟基化等。例如：红霉素合成中，先由聚酮体途径合成14元大环结构，然后在糖基转移酶的作用下，分别在3’和5’位连接碳霉糖和红霉糖，形成红霉素D。然后在羟基化酶的催化下在C12位形成羟基，并在甲基转移酶的催化下，使碳霉糖上的2’位羟基甲基化，最后形成有活性的红霉素A。第四节次级代谢产物生物合成中的调控酶合成的诱导调节反馈调节磷酸盐的调节碳分解产物的调节作用氮分解产物的调节作用产生菌生长速率的调节次级代谢途径中的某些酶是诱导酶，也是在底物（类似物）的作用下形成的。诱导酶合成的诱导物，有的是外源加入，叫外源诱导剂，有的是菌体代谢过程中产生的，叫内源诱导剂。（一）酶合成的诱导调节（二）反馈调节1.次级代谢产物的自身反馈抑制2.前体物质的自身反馈抑制3.支路产物的反馈抑制4.次级代谢产物的自身反馈阻遏1、次级代谢产物的自身反馈抑制：存在于大部分产物，例：•产黄青霉菌E-15：15g/L完全抑制合成PC，Q176菌株----2g/L的PC，NRRL1951---0.2g/L的PC。•美伐他汀生产菌：Penicilliumcitrinum（桔青霉）MV-66：最低抑菌浓度(MIC)=60g/L。•阿卡波糖游动放线菌AC-29：MIC=20g/L。氯霉素和芳香族氨基酸的生物合成和调节赤藓糖-4-磷酸+磷酸烯醇丙酮酸莽草酸脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAPH)对氨基苯丙氨酸分支酸氯霉素预苯酸酪氨酸邻氨基苯甲酸苯丙氨酸1，DAPH合成酶；2，分支酸合成酶；3，邻氨基苯甲酸合成酶；4，分支酸变位酶；5，预苯酸脱氢酶；6，预苯酸脱水酶；7，芳胺合成酶色氨酸7654321阻遏作用抑制作用2、前体物质的自身反馈抑制图青霉素生物合成前体缬氨酸的自身反馈抑制产黄青霉生物合成赖氨酸和青霉素的分枝途径a-酮戊二酸+乙酰辅酶A高柠檬酸赖氨酸异青霉素N青霉素G反馈抑制a-氨基己二酸柠檬酸合成酶3、支路产物的反馈抑制1.磷酸盐能促进初级代谢，抑制菌体的次级代谢在微生物的代谢中，磷酸盐除影响糖代谢、细胞呼吸及细胞内ATP水平外，还控制着产生菌的DNA、RNA、蛋白质和次级代谢物的合成。2.过量磷酸盐抑制次级代谢产物前体的生物合成3.磷酸盐阻抑次级代谢中的磷酸酯酶在链霉素生物合成中，有几个步骤是在磷酸酯酶作用下的去磷酸反应，而此磷酸酯酶受到无机磷酸盐的调节。葡萄糖肌醇链霉胍磷酸盐焦磷酸6-磷酸葡萄糖环化醛缩酶链霉素（三）磷酸盐的调节ATP直接影响次级代谢产物合成和糖代谢中某些酶的活性。四环素的生物合成4.ATP的调节作用磷酸烯醇式丙酮酸乙酰CoA乙酰CoA羧化酶丙二酰CoA菌体生长期占主导地位磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸羧基转移酶四环素合成期起决定作用两条途径因此，强化第二条途径有利于四环素的合成。而第二条途径中的草酰乙酸是TCA循环中的重要中间产物，催化其形成的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的合成受ATP和过量磷酸盐的强烈抑制，从而降低了草酰乙酸的生成，最终降低了四环素生物合成前体丙二酰CoA的浓度，影响四环素的生物合成。磷酸烯醇丙酮酸盐羧化酶金霉素链霉素中可能存在的三羧酸循环调节机制葡萄糖磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸乙酰CoA丙二酰CoA脂类四环素草酰乙酸异柠檬酸柠檬酸-酮戊二酸a(PO3)nATPADPAMPO2H2Oe-磷酸烯醇丙酮酸盐羧化酶柠檬酸合成酶××5.磷酸盐对次级代谢产物合成酶的调节作用于生物合成酶的基因，对生物合成酶的表达起负作用磷酸酶对已经产生的酶活性也有调节作用同一株抗生素产生菌在不同的磷酸盐浓度下合成不同的抗生素。例如棒状链霉素在高浓度磷酸盐培养，合成头霉素，低浓度磷酸盐培养合成克拉维酸。过量磷酸盐对四环类、氨基糖苷类和多烯类、大环内酯类等32种抗生素的生物合成产生阻抑作用。这些次级代谢产物的生物合成只有在适当的磷酸盐浓度下才能进行。磷酸盐浓度的高低还能调节次级代谢产物合成期出现的早晚，当磷酸盐接近耗尽时，才开始进入次级代谢产物的合成期。磷酸盐起始浓度高，耗尽时间长，合成期就向后拖延。磷酸盐还能使处于非生长状态的、产抗生素的菌体逆转成生长状态的、不产抗生素的菌体。（四）碳分解产物的调节作用是指易被菌体迅速利用的碳源及其分解产物对其他代谢途径的酶类的调节作用。葡萄糖效应阻遏作用是由于菌体在生长阶段，速效碳源(如葡萄糖和柠檬酸等)的分解产物阻遏了次级代谢过程中酶系的合成，只有当这类碳源耗尽时，才能解除其对参与次级代谢的酶的阻遏，菌体才能转入次级代谢产物的合成阶段。青霉素发酵中加入葡萄糖，有利于菌体生长，却抑制了青霉素的合成；而在培养基中加入乳糖，由于乳糖需要水解为葡萄糖和半乳糖，因此利用较为缓慢，对青霉素的合成没有抑制作用。放线菌素的生物合成过程中抗生链霉菌生物合成吩恶嗪酮合成的酶(PHS)受到碳分解产物的调控，高浓度的葡萄糖强烈地阻遏其合成，但却不能阻遏经pPH24转化的变青链霉菌中PHS的合成，这个事实提示从抗生链霉菌中克隆到的DNA片段带有自己的启动子，没有产生葡萄糖效应的调节序列，或是在变青链霉菌中不存在参与调控的负调节蛋白。常采用其他碳源生物合成都受到葡萄糖的阻遏的许多次级代谢产物，如麦角生物碱、头孢菌素C、螺旋霉素、紫色杆菌素、嘌呤霉素、吲哚霉素.新生霉素合成，如果培养基中柠檬酸和葡萄糖同时存在，菌体优先利用柠檬酸，此时不合成新生霉素，只有当柠檬酸被耗竭和出现二次生长时，菌体才开始利用葡萄糖并合成新生霉素。对大肠杆菌的碳代谢物阻遏实质的研究表明阻遏作用是葡萄糖通过细胞膜进入细胞时被磷酸化，在脱磷酸化的过程中磷酸转移酶(PCT)系统灭活了腺苷酸环化酶，从而减少了细胞内的环腺苷酸(cAMP)的形成。外源加入cAMP可以解除阻遏作用。实验还证明这种分解代谢产物的阻遏作用是发生在转录水平上的。蛋白质、黄豆饼粉等利用较慢的氮源，可以防止和减弱氮代谢物的阻遏作用，有利于次级代谢产物的合成；无机氮或简单的有机氮等容易利用的氮作为氮源(胺盐、硝酸盐、某些氨基酸)时，能促进菌体的生长，却不利于次级代谢产物的合成。（六）氮分解产物的调节作用谷氨酸和丙氨酸能阻遏参与放线菌素合成的犬尿氨酸甲酰胺酶Ⅱ的形成，抑制放线菌素的合成；半胱氨酸和甲硫氨酸能阻遏参与链霉素生物合成的甘露糖苷链霉素合成酶的形成，影响链霉素的合成；铵能阻遏参与B-内酰胺抗生素生物合成的三肽合成酶(ACV)和脱乙酰氧头孢菌素C合成酶的形成，导致它们的合成受到抑制。利福霉素的合成中，发现硝酸盐能促进其生物合成，原因：①硝酸盐的存在可以促进糖代谢和三羧酸循环酶系的活力以及琥珀酰CoA转化为甲基丙二酰CoA的酶活力，从而为利福霉素的合成提供更多的前体；②硝酸盐可以抑制脂肪酸合成，使部分合成脂肪酸的前体乙酰CoA转为合成利福霉素脂肪环的前体；③硝酸盐还能促进菌体GS的活力，使GS浓度降低,同样增加利福霉素前体的浓度。（六）产生菌生长速率的调节大多数发酵过程分为生长期和合成期。在生长期次级代谢产物合成酶受到阻遏作用，次级代谢产物不被合成。青霉素的化学结构式：青霉素有一个四氢噻唑环和内酰胺环。R代表侧链，不同类型的青霉素含有不同类型的侧链。用不同的菌种或培养条件不同，可以得到各种不同类型的青霉素，或同时产生几种不同类型的青霉素。青霉素简介：四氢噻唑环内酰胺环侧链6-APA（6-氨基青霉烷酸）青霉素的生物合成途径酰基转移酶酰化酶青霉素G6-APAACV合成酶IPN合成酶青霉素合成的调节方式：碳分解代谢产物的影响赖氨酸的反馈调节氮调控磷酸盐调控硫调控1碳分解代谢产物的影响青霉素的生物合成受碳分解代谢产物阻遏，如ACV合成酶，IPN合成酶，酰基转移酶就被阻遏。葡萄糖可以刺激菌体生长，使作为Lys和青霉素合成中间体的α-氨基己二酸转向合成Lys，抑制青霉素的合成。α-酮戊二酸+乙酰CoA高柠檬酸顺-高乌头酸高异柠檬酸α-氨基己二酸σ-腺苷-α-AAA赖氨酸L-α-AAA-L-半胱氨酸异青霉素N青霉素G产黄青霉赖氨酸和青霉素的生物合成途径高柠檬酸合成酶葡萄糖降低青霉素生物合成的速率和得率还由于葡萄糖与6-APA之间形成复合物，从而减少了可用于合成青霉素的中间产物。葡萄糖有利于菌的生长，但抑制青霉素的合成，而乳糖虽被缓慢利用，却是产生青霉素的最好碳源。碳源的缓慢利用是大量合成青霉素的关键。2赖氨酸的反馈调节α-氨基己二酸的初级代谢产物是赖氨酸，分枝次级代谢产物是青霉素。赖氨酸能抑制青霉素的合成，α-氨基己二酸能逆转这种抑制。赖氨酸能反馈抑制高柠檬酸合成酶，导致α-氨基己二酸合成受阻，因而减少青霉素的合成。α-酮戊二酸+乙酰CoA高柠檬酸顺-高乌头酸高异柠檬酸α-氨基己二酸σ-腺苷-α-AAA赖氨酸L-α-AAA-L-半胱氨酸异青霉素N青霉素G产黄青霉赖氨酸和青霉素的生物合成途径高柠檬酸合成酶3氮调控产黄青霉生物合成青霉素能高浓度的铵离子抑制，这种抑制与谷胺酰胺合成酶有关：NH4+↗，谷氨酸浓度↗，青霉素↘。NH4+还能直接阻遏产黄青霉的青霉素合成基因的表达。如：乳糖培养的产黄青霉菌加入40mmol/LNH4Cl，ACV合成酶和IPN合成酶的基因受到阻遏，这种阻遏通过氮调控蛋白介导，它能结合到启动子区影响其表达。4磷酸盐调控磷酸盐可强化产黄青霉的葡萄糖阻遏，其本身对青霉素的合成没有明显影响。5.硫调控硫酸盐作为前体氨基酸半胱氨酸合成酶原料，在青霉素合成中起着重要作用。高浓度的硫酸盐阻遏低产产黄青霉菌株的硫酸盐通透酶而影响摄取，在硫酸盐饥饿时，该酶活性及硫酸盐摄取率上升。高产产黄青霉菌株呈现脱阻遏现象，即使在较高的硫酸盐浓度下仍具有较高的通透酶活性。万古霉素的生物合成据研究，天然的万古霉素生物合成共有35步，其先以五种自由的氨基酸单体合成一线形的七肽，然后芳基边链在交联酶的催化下适时地组合、交联，形成复杂的七肽骨架，最后UDP-glucose和UDP-4-epi-vancosamine在糖基转移酶的作用下连接到七肽骨架上。万古霉素生物合成的五种起始自由氨基酸单体万古霉素生物合成的逆向合成分析图在万古霉素家族中发现的糖基GtfE糖基转移酶识别并将UDP-glucose转移至七肽骨架上GtfD糖基转移酶识别并将4－epi－vancosamine连接至万古霉素骨架上小结：次级代谢产物的基本特征次级代谢产物的构建单位次级代谢产物的生物合成过程次级代谢产物生物合成中的主要控制机制