第四章-兽医生物制品的灭活剂、佐剂及保护剂

第四章兽医生物制品的灭活剂、佐剂及保护剂云南农业大学动物科学技术学院孙永科博士【知识目标】熟悉兽医生物制品生产中常用的灭活剂、佐剂及保护剂;理解灭活剂、佐剂及保护剂在兽医生物制品生产中的作用;掌握灭活剂、佐剂、保护剂的概念;影响灭活剂作用的因素;影响保护剂效能的因素。了解佐剂的基本要求及类型;保护剂的组成、效能。【能力目标】能进行白油佐剂的乳化。第一节灭活与灭活剂为了提高兽医生物制品的安全性、防止散毒，许多疫苗通常通过灭活制成无毒力和无感染性的制品，灭活乃是兽医生物制品中的一项基本技术。一、灭活及灭活剂的概念灭活(inanimation)是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力及致病性，但尽可能不影响其免疫原性，用以制备灭活疫苗。广义的灭活尚包含灭能(inactivation)，即使一些活性物质(微生物及其代谢产物、激素、酶、血清因子和抗体等)丧失活力的过程。各种灭活疫苗、诊断抗原等的制造过程均属于灭活;血清经56℃加热30min处理，使补体丧失活性、破坏一些抑制因子的过程，以及破伤风毒素经甲醛处理后即失去致病性成为类毒素的过程均为灭能。用来灭活的药物称为灭活剂（inactivator），又称化学灭活剂。化学灭活是制备灭活苗最重要的手段。二、灭活的类型按照灭活作用的性质可将灭活分为物理灭活和化学灭活两类，尤以化学灭活法效果确实、方法简便而最为常用。对不同的微生物、活性物质所采用的灭活方法、灭活剂也不尽相同。因此，选择合适的灭活剂和灭活方法对研制灭活兽医生物制品十分重要。(一)物理灭活一般常用热灭活、超声波灭活、紫外线灭活和7射线灭活等方法杀死微生物或消除其毒性。热灭活最早由Smith等研制猪霍乱灭活菌苗时提出，后来发现热灭活容易发生菌体蛋白质变性。过去用加热灭活方法者较多。该法简单易行，但加热杀死微生物的方法比较粗糙，容易造成菌体蛋白质变性，因而免疫原性受到明显影响。超卢波裂解细胞灭活应放在冰浴中间断进行。紫外线灭活效果不够好，曾发生过经紫外线灭活的强毒重新活化的例子。Y射线灭活应根据被照射物的容量大小选择照射距离和照射强度。目前，除诊断抗原尚采用物理灭活(主要是热灭活)外，一般很少使用。(二)化学灭活利用化学药品或酶使微生物、活性物质的一些结构发生改变，从而丧失生命力、感染性、毒性或活性。化学灭活法是目前采用最多的灭活法，但化学灭活的效能常受灭活剂种类、剂量和作用温度、pH、时间等因素影响，因此必须筛选最佳的灭活条件。在特定条件下，物理灭活与化学灭活也可联合用于某些生物制品的灭活。三、常用灭活剂早在1911年，Lowenstein和Eisler就用甲醛处理破伤风毒素，使之脱毒而成类毒素。以后，Puntonii(1924)以0.1%苯酚或0.1%甲醛处理制成犬瘟热灭活苗，Dorset等(1934,1936)用结晶紫灭活猪瘟病毒制成猪瘟结晶紫疫苗。至20世纪80年代，随着化学灭活剂研究的快速发展，已筛选出不少效果优良的灭活剂。(一)甲醛我国卫生部1979年颁发的《生物制品规程》中所列的灭活疫苗共16种，其中用甲醛灭活的疫苗占81％；农牧渔业部1984年发布的《兽医生物制品制造及检验规程》中的20种灭活疫苗，以甲醛灭活者达17种，占85％。农业部2000年发布的《兽医生物制品制造及检验规程》中的26种灭活疫苗，均以甲醛作为灭活剂。甲醛的灭活机制是还原作用，低浓度时能破坏微生物的生命链，从而丧失活力或毒性而保存抗原性;高浓度时与微生物蛋自质(含酶蛋自)的氨基结合形成另一种化合物，从而破坏、杀死微生物。(一)甲醛甲醛用于疫苗灭活的浓度为0.1％～0.8%。一般需氧细菌用0.1％～0.2%的浓度，厌氧菌则多用0.4％～0.5％的甲醛杀菌或脱毒。37～39℃处理24h以上，有的需要更长时间。例如猪肺疫灭活苗，用0.1%的甲醛溶液，37～38℃灭活7～12h；气肿疽灭活苗，用0.5％的甲醛液，37～38℃灭活72～96h而破伤风类毒素用0.4%甲醛液，37～38℃灭活21～23d。甲醛用于病毒灭活其浓度可在0.05%～0.4％，大部分使用0.1％～0.3％。不论是杀菌或脱毒，使用甲醛或其他灭活剂，灭活剂的浓度及处理时间都要根据实验的结果来确定。通常以用量小(浓度低)、杀菌处理时间短而又能达到彻底灭活目的为原则。为了中止在灭活结束后的作用，要用焦亚硫酸钠阻断。(二)苯酚苯酚(Phenol)又称石炭酸(Carbolicacid)，为无色结晶或白色熔块，有特殊气味，有毒及腐蚀性，易潮解，溶于水及有机溶剂。置于空气中和阳光下易被氧化变红，在碱性条件下更易促进这种变化，所以应避光保存。苯酚的灭活机制是使微生物蛋白质变性和抑制特异酶系统的活性(如脱氨酶、氧化酶等)，从而导致微生物死亡。生物制品的常用量为0.3%～0.5%。(三)β-丙内酯β-丙内酯(β-Propiolactone，BPL)又名羟基丙酸-β-内酯。分子式为C4H4O2，是一种良好的病毒灭活剂，它是一种不稳定的无色有刺激气味的液体，于37℃条件下2h后能自行水解为无毒物质。水中能溶解体积分数为37%的β-丙内酯，它能与丙酮、乙醚和氯仿任意混合，对皮肤、黏膜及眼有刺激性，其液体对动物有致癌性。β-丙内酯的灭活机制是破坏病毒的核酸芯子，但不损害衣壳蛋白，因此能保持良好的免疫原性，主要用于狂犬病灭活苗的制备。然而，目前的研究表明，β-丙内酯是一种潜在的致癌因子。(四)结晶紫结晶紫(Crystalviolet)是一种碱性染料，别名甲基青莲或甲紫。为带有金属光泽的绿色结晶或深绿色结晶状粉末，易溶于醇，能溶于氯仿，不溶于水和醚。结晶紫的灭活机制主要是它的阳离子与微生物蛋白质带负电的羧基形成弱电离化合物，妨碍了微生物的正常代榭，扰乱微生物的氧化还原作用，使电势太高而不适于微生物的增殖。对革兰氏阳性菌主要是干扰胞壁肽聚糖的合成。(五)硫柳汞硫柳汞(Merthiolatesodium)，又称乙基汞硫代水杨酸钠。为无色结晶或乳白色粉末，微有特殊气味，易溶于水，溶于乙醇，不溶于乙醚、苯。在空气中稳定，在日光下不稳定，故应密闭避光保存。用作生物制品的防霉和消毒剂，对霉菌、细菌和病毒都有一定的灭活作用。常用浓度为0.01%～0.02%。(六)烷化剂烷化剂(Alkylatingagent)是含有烷基的分子中去掉一个氢原子基团的化合物，它能与另一种化合物作用，将烷基引入，形成烷基取代物。这类化合物的化学性质活泼，其灭活机制是烷化微生物DNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤，引起单链断裂、双螺旋链交联及干扰酶系统和核蛋白作用，从而破坏核酸代谢、合成，导致病毒核酸芯子破坏而达到灭活目的。烷化剂灭活，可使病毒丧失感染力而不损害蛋白壳，得以保留其抗原性。因此，这类灭活剂能破坏病毒核酸芯髓，使病毒完全丧失感染力，而又不损害其蛋白衣壳，得以保留其保护性抗原。这类烷化剂常用的有N-乙酰乙烯亚胺(N-Acetylethylenimine，AEI)，二乙烯亚胺(Binaryethylenimine,BEI)及缩水甘油醛(Glyceraldethyde,GDA)等。1.N-乙酰乙烯亚胺AEI为淡黄色透明液体，有轻微氨臭味，能与水或醇任意混合。pH7.0～8.5，最适保存温度-79℃，在0～4℃可保存1年，在-20℃可保存2年；但AEI在常温下由于分子聚合，外观颜色及流动性均发生变化，从而导致灭活作用的改变。AEI起作用的功能基团是乙烯亚胺基，用于灭活口蹄疫病毒生产口蹄疫灭活疫苗。在口蹄疫病毒培养液咋，加入最终浓度为0.05%，30℃、8h后，达到灭活目的。加入最终浓度为2%的硫代硫酸钠，即可中断灭活剂的灭活作用。2.二乙烯亚胺BEI市售商品为浓度0.2%的溶液，在0～4℃可保存1个月，在口蹄疫病毒悬液中加入最终浓度为0.02%的BEI可对病毒进行较好的灭活。当灭活结束时，加入最终浓度为2%的硫代硫酸钠阻断灭活作用。3.缩水甘油醛GDA易挥发，水溶液含量为15～30mg/ml。0～4℃保存3个月后含量逐渐下降，约半年失效，20℃只能保存10d。GDA的作用机理是环氧烷基与病毒蛋白或核酸发生反应。对大肠杆菌、噬菌体、新城疫病毒、口蹄疫病毒等有灭活作用。近30年来，许多科学家对烷化剂在灭活口蹄疫病毒时的灭活速度、毒性、保存性等方面进行比较，结果证明AEI和BEI性能良好，已成功地用于疫苗的生产，特别是BEI由于其保存、毒性及成本等更为优越而被人们广泛采用。四、影响灭活作用的因素所谓灭活效果，一是指灭活的完全性，即被灭活物的活性(毒性)是否能完全丧失或破坏;二是指灭活后是否保留良好的抗原性，即灭活物是否仍有抗原高效价和坚强的免疫力。火活效应，尤其是化学灭活的效应，常受剂量、温度、时间、pH、灭活物种类和浓度等因素制约。因此，在生物制品制造中，除应筛选出良好的灭活剂外，还要选定最佳的灭活剂量、温度、时间和pH等条件。(一)灭活剂种类不同的灭活剂对同一种微生物的灭活效果也不同。某些药物只对一部分微生物有明显的灭活作用，而对另一些微生物则效力很差。如酚类能抑制和杀灭大部分细菌的繁殖体，5%石炭酸溶液于数小时内能杀死细菌的芽抱。真菌和病毒对酚类不太敏感。阳离子表面活性剂抗菌谱广，效力快，对组织无刺激性，能杀死多种革兰氏阳性菌和阴性菌，但对绿脓杆菌和细菌芽抱作用弱，其水溶液不能杀死结核杆菌。因此在选择灭活剂时，应考虑其特异性，即对微生物的作用范围。(二)微生物种类及其特性不同种类的微生物如细菌、病毒、真菌以及革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌对各类灭活剂的敏感性是不完全相同的:细菌的繁殖体及其芽抱对化学药物的抵抗力不同;生长期和静止期的细菌对灭活剂的敏感程度亦有差别。另外细菌的浓度也会影响灭活的效果。(三)灭活温度通常同一浓度的灭活剂在不同温度的灭活速度与温度成正比。在低温时，温度每上升10℃，细菌死亡率可成倍增加。每升高10℃，金属盐类的杀菌作用增加2～5倍，石炭酸的杀菌作用增加5～8倍。但是，如果温度超过40℃或更高，对微生物的抗原性将有不利影响。(四)灭活剂浓度以甲醛为例，甲醛浓度越高，灭活脱毒越快，但抗原损失量亦较大，有人证明，加0.5％甲醛溶液脱毒的类毒素，其结合力仅相当于0.2%甲醛溶液脱毒的类毒素结合力的明。也可以采用分次加入甲醛溶液进行灭活这种脱毒比较缓和的方法。将拟加的甲醛溶液分数次加入，加量由小至大，pH由低到高，温度起初为室温，继而转为允许的最高温度，这样对于保护抗原的免疫原性有一定好处。(五)灭活时间灭活时间与灭活剂浓度和灭活温度密切相关。一般随着灭活剂浓度及作用温度升高，灭活所需时间缩短。但为了保证制品质量，一般采用低浓度、低温和短时间处理为最佳。(六)pH在微酸性时灭活速度慢，抗原性保持较好，在碱性时灭活速度快，但抗原性易受破坏。对细菌的灭活作用，pH有重大影响，pH改变时，细菌的电荷也发生改变。在碱性溶液中，细菌带阴电荷较多，所以阳离子表面活性剂的杀菌作用较大。在酸性溶液中，则阴离子的杀菌作用较强。灭活初期损失较快，以后逐渐减慢，尤其甲醛溶液浓度高时，在碱性溶液中抗原性损失更大。同时，pH也影响灭活剂的电离度，一般说来，未电离的分子较易通过细菌细胞膜，灭活效果较好。(七)微生物含氮量一般微生物或毒素的总氮量和氨基氮含量对灭活有一定影响。一般含氮量越高，甲醛等灭活剂的消耗量就越大、灭活脱毒越慢。(八)有机物的存在生物制品中含有较多的有机物质，这些蛋白质等有机物吸附于灭活剂的表面或者和灭活剂的化学基团相结合，会影响灭活剂的灭活能力。受这种因素影响最大的为苯胺类染料、汞制剂及阳离子去污剂。一旦汞制剂与含硫氢基化合物相遇或季铵盐类与脂类结合，则明显降低这些灭活剂的作用。常用灭活剂及灭活方法见表4-1。第二节佐剂一、佐剂的概念佐剂(adjuvant)一词来源十拉丁语，原为辅佐之意。当一种物质先于抗原或与抗原混合或同时注射于动物体内，能非特异性地改变或增强抗原物质的免疫原性，增强机体的免疫应答，或者改变机体免疫应答类型，这种物质称为佐剂，也称免疫佐剂(im