普鲁兰短梗霉HN2_3脂肪酶的生产_分离纯化_基因克隆和表达的研究_

51.3脂肪酶活力的测定用于检测脂肪酶活力常用的底物有：三油酸甘油酯和橄榄油。一般能水解三油酸甘油酯的酶都是脂肪酶。但三油酸甘油酯的价格较贵，一般常用橄榄油代替，它含有70%以上的油酸，且价格便宜来源广，在酶活力测定中被广泛使用。由于橄榄油不溶于水而酶解反应只能在油一水界面上，为了使脂肪酶充分作用，常采用在橄榄油中加聚乙烯醇或阿拉伯胶等乳化剂，用高速搅拌或超声波处理等措施使油以微颗粒状态充分分散，使之成为均匀稳定的乳化液。测定反应中释放出的游离脂肪酸，可用碱滴定法或与NaHCO3反应后测CO2压力，也可用电位滴定。碱滴定法应用较为广泛，由底物、缓冲液和酶液组成的作用系统，在一定的pH和温度下保温一段时间后，用95%的乙醇终止反应，加入指示剂，用标准碱液滴定（何耀强等，2004）。比色法也比较常见，以对硝基苯月桂酸酯（pNPL）为底物的pNPL法（Winkleretal.,1979）是对硝基苯月桂酸酯在脂肪酶的催化作用下，分解生成月桂酸和对硝基酚，利用对硝基酚在410nm光波下可被检测的性质，用吸光光度计来测定底物分解产生得到的对硝基酚的量，从而换算出酶活的大小。2微生物脂肪酶的生产脂肪酶广泛存在于动植物和微生物中。由于微生物种类繁多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物酶更广泛的作用pH、作用温度范围以及底物的专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性胞外酶，适合于进行工业化大生产和获得高纯度样品，以上众多的优越性确定了微生物脂肪酶在理论研究、工业化生产和实际应用中的重要性，从20世纪60年代开始，国外学者就致力于微生物脂肪酶的研究，到目前为止，大部分商业用脂肪酶都来源于微生物。表1-1列出了一些产脂肪酶的微生物。6表1-1产脂肪酶的微生物Table1-1Somelipase-producingmicroorganismsSourceGenusSpeciesReference(s)BacteriaBacillusB.megateriumGodtfredsen,1990(Gram-positive)B.cereusEl-ShafeiandRezkallah,1997B.stearothermophilusGowlandetal.,1987;B.subtilisKennedyandRennarz,1979B.brevisHou,1994B.thermocatenulatusRuaetal.,1998B.coagulansEl-ShafeiandRezkallah,1997B.acidocaldariusMancoetal.,1998B.thermoleovoransID-1Leeetal.,1999StaphylococcusS.canosusTahounetal.,1985S.aureusLeeandYandolo,1986S.hyicusVanOortetal.,1989;S.epidermidisFarrelletal.,1993;S.warneriTalonetal.,1995LactobacillusL.delbruckiiEl-Sawahetal.,1995subsp.bulgaricusStreptococcusS.lactisSztajeretal.,1988MicrococcusM.freudenreichiiHou,1994M.luteusHou,1994PropionibacteriumPr.acneSztajeretal.,1988Pr.granulosumSztajeretal.,1988BurkholderiaBu.glumaeElKhattabietal.,2000BacteriaPseudomonasP.aeruginosaAoyamaetal.,1988;(Gram-negative)P.fragiMencherandAlford,1967P.mendocinaJaegerandReetz,1998P.putida3SKLeeandRhee,1993P.glumaeFrenkenetal.,1993;P.cepaciaPencreac’handBaratti,1996;P.fluorescensMaragoni,1994;P.aeruginosaKKA-5Sharonetal.,1998P.alcaligenesF-111Linetal.,1995,1996P.fluorescensMF0Guillouetal.,1995ChromobacteriumCh.viscosumReesandRobinson,1995;AcinetobacterAci.pseudoalcaligenesSztajeretal.,1988Aci.radioresistensChenetal.,1999AeromonasAe.hydrophilaAnguitaetal.,1993Ae.sorbiaLP004LotrakulandDharmsthiti,1997FungiRhizopusRhizop.delemarKleinetal.,1997;Rhizop.oryzaeSallehetal.,1993;Rhizop.arrhizusSztajerandMaliszewska,1989;7Rhizop.nigricansGhoshetal.,1996Rhizop.nodosusNakashimaetal.,1988Rhizop.microsporousGhoshetal.,1996Rhizop.chinensisGhoshetal.,1996Rhizop.japonicusNakashimaetal.,1988Rhizop.niveusKohnoetal.,1994,1999AspergillusA.flavusLongetal.,1996,1998A.nigerChenetal.,1995A.japonicusSatyanarayanandJohri,1981A.awamoriSatyanarayanandJohri,1981A.fumigatusSatyanarayanandJohri,1981A.oryzaeOhnishietal.,1994a,bA.carneusHelistoandKorpela,1998A.repensKaminishietal.,1999A.nidulansMayordomoetal.,2000PenicilliumPe.cyclopiumChahinianetal.,2000Pe.citrinumSztajerandMaliszewska,1989Pe.roquefortiPetrovicetal.,1990Pe.fumiculosumHou,1994Pe.camambertiiGhoshetal.,1996Pe.wortmaniiCostaandPeralta,1999MucorMucormieheiRantakylaetal.,1996;Mu.javanicusIshiharaetal.,1975Mu.circinelloidesBalca˜oetal.,1998Mu.hiemalisGhoshetal.,1996Mu.racemosusGhoshetal.,1996AshbyaAshbyagossypiiStahmannetal.,1997GeotrichumG.candidumSugiharaetal.,1991;BeauveriaBeauveriabassianaHegedusandKhachatourians,1988HumicolaH.lanuginosaGhoshetal.,1996;RhizomucorR.mieheiMerekandBednasski,1996;FusariumFusariumoxysporumRapp,1995F.heterosporumTakahashietal.,1998AcremoniumAc.strictumOkekeandOkolo,1990AlternariaAlternariabrassicicolaBertoetal.,1997EurotriumEu.herbanoriumKaminishietal.,1999OphiostomaO.piliferumBrushetal.,1999YeastsCandidaC.rugosaWangetal.,1995;Frenseetal.,1996;Yeeetal.,1995;Broccaetal.,1998;Xieetal.,1998C.tropicalisTakahashietal.,1998C.antarcticaWeberetal.,1999;8C.cylindraceaKamiyaandGotto,1998;C.parapsilosisLacointeetal.,1996C.deformansLacointeetal.,1996C.curvataGhoshetal.,1996C.validaGhoshetal.,1996YarrowiaY.lipolyticaMerekandBednasski,1996;Pignedeetal.,2000RhodotorulaRho.glutinisPapaparaskevasetal.,1992Rho.pilimornaeTahounetal.,1985PichiaPi.bisporaHou,1994Pi.maxicanaHou,1994Pi.sivicolaSugiharaetal.,1995Pi.xylosaSugiharaetal.,1995Pi.burtoniiSugiharaetal.,1995SaccharomycesSa.lipolyticaTahounetal.,1985Sa.crataegenesisHou,1994TorulosporaTorulosporagloboraHou,1994TrichosporonTrichosporonasteroidesDharmsthitiandAmmaranond,1997ActinomycetesStreptomycesStreptomycesfradiaeNCIBSztajeretal.,19888233Streptomycessp.PCB27Sztajeretal.,1988Str.coelicolorHou,1994Str.cinnamomeusSommeretal.,19972.1产脂肪酶微生物的分离产脂肪酶微生物存在于多种生活环境中，包括工业废水、植物油加工厂、乳品、油污染土壤、腐烂食物(Sztajeretal.,1988)、堆肥、以及温泉(Wangetal.,1995)等等。Sierra(1957)报道了一种简单且可靠的检测脂肪酶活性的方法，在固体培养基中加入Tween80，以菌落周围形成不透明区作为检测微生物产脂肪酶的标准。1987年井上惠雄等使用含三丁酸甘油酯的琼脂培养基对一些微生物进行研究，发现产脂肪酶的菌落外围产生透明带。但是，由于三丁酸甘油酯并非是脂肪酶的单一底物，还是酯酶的底物，因而人们对此方法的可靠性存在异议。1987年，GiselaKouker等用含三油酸甘油酯和荧光染料的琼脂平板对细菌及其培养液保温后可在350nm的紫外光下观察到荧光水解带，但此水解带不能用肉眼观察到。9近年来人们又改进了几种酶活测定方法，Wang等(1995)使用罗丹明B显色圈法也取得了比较好的效果。2.2脂肪酶的发酵生产脂肪酶的生产主要通过液体发酵（Itoetal.,2001），固体发酵的方法也被使用（Chisti,1999a），在少数情况下，脂肪酶的生产还使用固定化细胞培养的方法（Hemachanderetal.,2001）。在液体发酵培养中，脂肪酶的生产受到碳源、氮源、pH、培养温度、溶氧浓度等诸多因素的影响（ElibolandOzer,2001）。油脂碳源总体来说是获得高产量脂肪酶的必不可少的因素，但是，少数研究者在不使用油脂作为碳源时，也取得了不错的效果。2.2.1碳源影响P