小鼠MEF细胞分离方法

一、实验材料准备1.动物孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。2.试剂无Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53mmol/LEDTA溶液、MEF生长培养基(高糖DMEM+10%FBS+双抗)。3.器械眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50ml和15ml离心管和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。二、具体操作1.处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。2.用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后去掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30mlD-PBS的50ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。3.用200μl的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15ml离心管中，于4℃1500rpm离心5分钟，倒掉上清，以10ml胰酶重悬沉淀，放在37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。4.将上层细胞悬液倒入一个装有10mlMEF生长培养基的50ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1500rpm离心5分钟收集细胞，再用30mlMEF生长培养基洗涤两次。5.细胞沉淀用15mlMEF生长培养基重悬后进行细胞计数(一般8只14天的胎鼠可获得2-3×107细胞)。6.3×106细胞悬浮于15mlMEF生长培养基中，接种到200ml培养瓶中。7.24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。8.细胞长满后，先用D-PBS冲洗，倒掉后加胰酶消化(此步时间不宜过长，作者一般不超过五分钟)，按1:5传代。9.细胞再次长到覆盖率80-90%左右，将其消化后，常规冻存(冻存液要现配)。小鼠胚胎成纤维细胞(MEF100倍)注意事项1.原代培养，一定要避免污染。2.MEF生存能力有限，如果不冻存，体外存活十代左右。3.冻存后复苏的细胞只能传代一次，因为这些细胞繁殖能力有限。4.消化细胞时间不要过长。