微生物之克雷伯菌

肺炎克雷伯菌分子检测陈颖曦江苏嘉语生物医药科技股份有限公司目录肺炎克雷伯靶点的确定与序列比对肺炎克雷伯种属鉴定常用靶点肺炎克雷伯和鲍曼不动杆菌简介鲍曼不动杆菌靶点的确定与序列比对参考文献肺炎克雷伯氏菌简介本菌革兰氏阴性，革兰阴性杆菌，大小为(0.3~1.5)μmX(0.6~6.0)μm。单个、成双或短链排列。痰标本直接涂片染色，菌体呈卵圆形或球杆状，单个或成双排列。英膜染色外周可见透明、环状荚膜。氧化酶试验阴性，发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖等多种糖类，TSI为A/A，IMViC--++，硝酸盐还原、脲酶和赖氨酸脱竣酶试验阳性，动力、H2S、鸟氨酸脱竣酶和精氨酸双水解酶试验均为阴性。肺炎克雷伯菌广泛分布于自然界水和土壤中，是人类呼吸道的常居菌，在人和动物肠道内也常见，是-种条件致病菌。在临床分离到的克雷伯菌属中，肺炎克雷伯菌占80%以上，是本属中最为常见的病原菌，可引起肺炎、脑膜炎、腹膜炎、泌尿系统感染、败血症等疾病。[1]。肺炎克雷伯氏菌革兰氏染色（阴性）克雷伯杆菌肺炎肠杆菌科其他属（肠杆菌属，埃希氏属等）克雷伯氏菌属K.pneumoniaeK.GranulomatisK.oxytocaK.terrigenaK.planticola分子检测常用靶点靶微生物基因名生理功能基因大小（bp）特异性敏感性KP16S[2]核糖体RNA126100%1ng/μL[2]K.sspgapA[3]甘油醛-3-磷酸脱氢酶450UnknowunknowKPHemolysin[4,12]溶血素Unknow假阳性[12]unknowKPITS[5,6,7]16S-23S间隔序列130100%unknowKPphoE[8,9,10]外膜磷酸盐孔蛋白209100%0.1ng/PCRKlebsiellaoxytocapehX[11]聚半乳糖醛酸酶344100%unknowKP肺炎克雷伯菌，K.ssp克雷伯属靶微生物基因名生理功能基因大小（bp）特异性敏感性KPrpoB[13]RNA聚合酶亚基108100%unknowKPWaaQ[14]LPSheptosylIII转移酶217100%unknowAB鲍曼不动杆菌，A.ssp不动杆菌属，A.genogroup不动杆菌基因型分组肺炎克雷伯菌16S序列比对选取551株肺炎克雷伯菌16S序列进行比对，产生比对文件由于仅有一篇文献描述了16S引物检测KP,且未将引物序列写明，故肺炎克雷伯16S没有“文献引物”肺炎克雷伯菌16S进化树肺炎克雷伯菌ITS序列比对选取254株肺炎克雷伯菌ITS序列进行比对，生成比对文件肺炎克雷伯菌ITS.apr肺炎克雷伯菌ITS进化树文献中肺炎克雷伯菌ITS引物PrimernameSequence（5→3）TargetingmicrobeLocationProductsize(bp)PF[1]Pr1ATTTGAAGAGGTTGCAAACGATTTCACTCTGAAGTTTTCTTGTGTTCKP262-286275-401130肺炎克雷伯菌phoE序列比对选取26株肺炎克雷伯菌phoE序列进行比对，生成比对文件phoE.apr肺炎克雷伯phoE进化树文献中肺炎克雷伯菌phoE引物PrimernameSequence（5→3）TargetingmicrobeLocationProductsize(bp)phoE-rhiF[1]phoE-rhiRGCGGCAGCGACTTCGCCGTAGTTCTGCGCTTTGTTGGCAAACKPsubsp.rhinoscleromatis不匹配不匹配209F[2]RTGCCCAGACCGATAACTTTACTGTTTCTTCGCTTCACGGKP593-612716-734142肺炎克雷伯菌耐药基因比对肺炎克雷伯菌耐药基因抗生素类别耐药机制相关基因分布率备注β-内酰胺类产水解酶ATEM-1(1a,1b),3,5?,10,11,12,24,26,27?,47,48,52,54,86,130,132[15,17,20,24,25,29,30,32,33,34,35,36,40,45,46,47,53,55,56,77,79,81,86]94%质粒介导SHV-1,2(2a),5,11,12,15?,25，26,27,28,32?,36,40,55,60,62,71?,73?,74?,75?,76?,77?,78?,79?,80?,81?,82?,83?,103[15,17,18,20,25,26,27,29,32,33,34,35,38,40,42,45.46,47,48,50,53,55,68,77,79,81,82,86]52.8%质粒介导“?”表明该基因未找到对应序列进行比对，已比对的基因没进行任何标记。抗生素类别耐药机制相关基因分布率备注β-内酰胺类产水解酶ACTX-M-2,3,9?,12,14,15,22,24,28,32,61?[15,18,22,26,30,31,33,34,35,38,43,45,46,47,53,55,56,59,61,64,67,75,77,79,85]94%质粒介导KPC-1,2,3,7[16,18,19,21,27,28,58,61,69,71,72,76,77,79]40.2%质粒介导,水解碳青霉烯类GES-1,3,4,7[18,40,55]unknownunknownVEB-1[18]unknownunknownPSE?[83]6/74unknown抗生素类别耐药机制相关基因备注β-内酰胺类产水解酶BVIM-1,19,27[18,44,60,61,67]unknownNDM-1[43]质粒介导IMP-1,4,8[78,83]非转移质粒CCMY-1,2,4,6,8,10,12,13?,19,31,56,87DHA-1EBC?CIT?FOX[18,23,33,37,38,39,40,42,48,49,60,73,74,85]质粒介导DOXA-1,2,10,17,30,48,48-like?,73[33,36,40,51,52,53,62]unknown抗生素类别耐药机制相关基因分布率备注β-内酰胺类产水解酶未知类Toho-1?[32]24/34日本OKP-A-11,13,14,15,16(比对文件名中没有具体细类名，以OKP-A为名)[34,38]17.85%染色体介导，肺炎克雷伯特有,chinaOKP-B-13,14[38]unknown染色体介导LEN-17[38]unknownunknownIBC?[45]unknownunknown抗生素类别耐药机制相关基因分布率备注β-内酰胺类外膜蛋白缺失或突变OmpK35[40,49，84]2/230(缺失率)染色体OmpK36[40,49，84]1/230(缺失率)染色体抗生素类别耐药机制相关基因备注氨基糖苷类钝化酶AAC(6)-Ib-cr(aacA)[29,41,42,43,59,62,66,67,70,79,51,74,85]质粒介导26/53AAC(3)-II[29,85]48/53APH(3’)?[29]unknownAnt(3”)-I(aadA)[41,51,53,74,83,84,85]非转移质粒13/53ant(2'')-Ia(aadB)[51]unknown抗生素类别耐药机制相关基因分布率备注氨基糖苷类16S甲基化酶armA[39,63,65]9/14(分母为耐药株数)质粒介导rmtB[39,63,65]1/14(分母为耐药株数)unknown抗生素类别耐药机制相关基因分布率备注喹诺酮类保护蛋白qnrB1,4,6,20[42,54,57,66,79]qnrA(4/21)qnrB(5.2%)qnrS(6/14耐药株比例)质粒介导qnrS1,2[44,54,62,66,70]质粒介导qnrA1[51,54,57,60,66,67]质粒介导靶点突变gyrA[80,82]主要机制染色体parC[80]主要机制染色体比对文件注意事项•①耐药基因多聚集成“簇”，有的单个比对文件中包含多个基因，在设计引物时，找准目标基因序列是关键。•②如果比对文件中包含多种目的基因，如β-内酰胺酶“IMP”基因，有“IMP-1，IMP-2等等”，在FASTA文件中改成了相应的名字，以示区别，如果比对文件中只包含一种目的基因，FASTA文件中仍保留其原始名称和名称格式，未作修改。③虽然在FASTA文件中，绝大部分成簇基因名称都改成“X（靶基因名）andothergenes”,以表示该条序列是靶基因和其他非靶标基因成的“簇”。但成簇基因名称在NTI序列比对软件中显示不完整，只显示把基因名，未显示“andothergenes”字样，在查看比对结果时，可打开FASTA原始文件一一对应查看，不过也可以根据基因序列长度来判断，一般的说，碱基数3000bp的序列是成簇基因序列，请注意鉴别。•④有些铜绿耐药基因序列在NCBI和欧洲数据库中找不到，就用了其他种的对应耐药基因替代，FASTA文件中基因名包含了种名，但在NTI序列比对软件中未显示，只显示了基因名。•⑤有些耐药基因未找到文献引物，或是有限的文献中的引物不便于复制操作而未归纳总结，还需另行设计。•⑥一些基因在文献中未提及但在NCBI上有记载，也选下来进行比对。TEM序列比对以下是肺炎克雷伯TEM序列比对文件，其中有TEM-1（75株），TEM-1b(3株)，TEM-1a(1株)，TEM-10（2株），TEM-11（1株），TEM-12（1株），TEM-24（2株），TEM-26B（1株），TEM-47（1株），TEM-48（1株），TEM-52（1株），TEM-54(1株)，TEM-86（1株），TEM-130(1株)，TEM-132（1株）共93株TEM序列。β-内酰胺类耐药基因比对文献中的TEM引物（通用引物）NameSequence(5’→3’)LocationProductsizeTEMF[1]TEMRTCCGCTCATGAGACAATAACCTTGGTCTGACAGTTACCAATGC3977-39974886-4907930FIN[2]DEBATTCTTGAAGACGAAAGGGCATGAGTAAACTTGGTCTGAC3825-38444898-49171092A[3]BATAAAATTCTTGAAGACGAAAGACAGTTACCAATGCTTAATCA3820-38404879-49001080F[4]RATGAGTATTCAACATTTTTACCAATGCTTAATCA4035-40514879-4895860A[5]BGAGTATTCAACATTTCCGTGTCTAATCAGTGAGGCACCTATCTC4037-40584863-4884847T1[6]T2CCGTGTCGCCCTTATTCCAGGCACCTATCTCAGCGA4052-40694858-4875823KPC序列比对选取肺炎克雷伯KPC-1(1株)，KPC-2（12株），KPC-3（2株），KPC-7（1株）进行比对。文献中KPC引物（通用引物）NameSequence(5’→3’)LocationProductsizeF[1]RGCTACACCTAGCTCCACCTTCACAGTGGTTGGTAATCCATGC不匹配8134-81541000KPC-1F[2]KPC-1RGCTACACCTAGCTCCACCTTCACAGTGGTTGGTAATCCATGC7166-7186不匹配989GES序列比对选取肺炎克雷伯菌GES-1（1株），GES-3（1株），GES-4（2株），GES-7（2株）序列进行比对。文献中GES引物（通用引物）NameSequence(5’→3’)LocationProductsizeGES-1F[1]GES-1RATGCGCTTCATTCACGCACCTATTTGTCCGTGCTCAGG1333-13512179-2197864GESF[2]GESRTTCCATCTCAAGGGATCACCGCGTCAACTATTTGTCC