质粒载体的概况及构建

质粒载体的概况及制备质粒的定义、命名1质粒的基本特性2质粒的分类3质粒载体的概况（一）质粒的定义、命名质粒的定义、命名：•定义：质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。•命名：小写字母p代表质粒，两个大写字母代表发明者，后面接实验编号。★质粒不是细菌生长所必须的★可赋予细菌抵御外界因素不利影响的能力★分子量在1~200kb之间质粒（plasmid）特点：能在宿主细胞内独立复制；带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞一些遗传性状。(1)自主复制性（二）质粒的基本特性质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）控制质粒拷贝数的基因能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制同一复制系统的不同质粒在同一细菌中不能相容不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存（2）不相容性（3）可扩增性•质粒能自主地进行复制，这样它才能随着细菌细胞的分裂而稳定地遗传。•质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复制。•松弛型复制：拷贝数高，一个细胞中可达上千个拷贝；•严谨型复制：拷贝数低，一个细胞中一般低于5个拷贝（1个－－几个）。（4）可转移性在天然条件下，大多数质粒可通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另一种宿主内。（例如：通过大肠杆菌接合）（三）质粒的分类人工构建的质粒载体分类：①高拷贝数的质粒载体②低拷贝数的质粒载体③失控的质粒载体④插入失活型克隆载体⑤正选择的质粒载体质粒的分类质粒的制备实验室一般使用两种方法制备质粒：（一）碱裂解法（二）沸水浴法（1）碱裂解法原理：利用溶菌酶在NaOH与SDS的混合溶液中破坏细菌外壁，去除染色体DNA及变性蛋白质，离心，苯酚—氯仿溶液处理，乙醇或异丙醇沉淀水相质粒。特点：质粒较纯，收获率高，繁琐且有开环现象（2）沸水浴法特点：质粒不纯，收获率低，制备规模小但快速，特别适用于重组质粒的鉴定。①用限制性内切酶消化DNA样品②用限制性内切酶消化质粒DNA③连接样品DNA和质粒DNA的消化产物④用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞⑤涂布在琼脂平板上进行耐抗菌素筛选典型的质粒克隆技术：④用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞时转化细菌有两个基本方法：一是化学法，即用CaCl₂处理并加热激以促进DNA进入菌体；二是电激法，即施加短脉冲的电荷以促进DNA吸收。⑤筛选时会有三种结果：一是要插入的序列自连，结果没有菌落形成；二是切开的质粒重连，结果表现为蓝色菌落；三是要插入的序列与质粒相连产生白色的抗氨苄青霉素菌落。THANKS