western-blot-详解

垂直电泳、电转装置•电泳槽玻璃板、梳子、加样校准架等•电转移槽切胶板、黑白夹板、海绵垫等•电泳仪用途：用于生物学实验中对特定目的蛋白质的分离，定性及定量的检测分析，是Western-blot（蛋白免疫印迹）实验中非常重要的部分。WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体（一抗）起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。Westernblot实验原理抗原一抗生物素标记的二抗ECL发光试剂Westernblot检测蛋白表达实验流程SDS-PAGE电泳的基本原理聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶是在PAGE凝胶中引进SDS（十二烷基磺酸钠，含有大量带负电荷的SO32-），SDS能破坏蛋白质分子的二级、三级结构，在含有强还原剂的溶液中可与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物。由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了，从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用，蛋白质在SDS-PAGE胶中的迁移率主要取决于其分子量的大小。PAGE：聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel)是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：•单体：丙烯酰胺（Acr）；•交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）；•催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）；•加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）；•产物：三维网状结构凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(freeradicals)的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redoxsystems)来完成的。催化体系主要有化学催化（AP—TEMED）和光化学催化（核黄素——TMTED）体系。一配分离胶准备物品：玻璃板洗衣粉灌胶架移液枪两个烧杯（1ml200ul20ul）30%Acrylamide1M（4度冰箱），Tris-HCL溶液（PH=8.8），ddH2O10%AP（-20冰箱），TEMD（4度），SDS（常温）1清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用ddH2O冲洗干净后立在通风处或烘箱中2配制分离胶：玻璃板对齐后放入夹中加紧，注意使两玻璃板对齐。然后垂直卡在架子上准备灌胶。先配制分离胶。配方如下：具体情况依照说明书灌分离胶：用1ml的移液枪吸取1ml胶沿玻璃放出，溶液缓慢加入到装配好的玻璃板中至凝胶高度为6cm左右，预留1.5cm高度配制浓缩胶。用1ml的移液枪吸取1ml左右的异丙醇，压平。沿玻璃放出，注意速度要慢，否则胶会被冲变形。温箱放置0.5-1h左右至聚合完全。注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速灌胶，灌胶速度须缓慢，避免产生气泡灌胶之上轻轻加一层异丙醇，用来压平灌制分离胶隔绝空气ddH2O0.1%SDS:8%异丁醇：8%二配制浓缩胶准备物品：移液枪烧杯（1ml200ul20ul）Tips：30%Acrylamide1M（4度冰箱），Tris-HCL溶液（PH=6.8），ddH2O10%AP（-20冰箱），TEMD（4度），SDS（常温）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已经凝了。倾倒掉胶上层的异丙醇，后用吸水纸吸干。注意吸水纸不要触碰分离胶10%的分离胶配合6%的浓缩胶使用。配制浓缩胶，配方如下：6%的浓缩胶4mlddH2O2.39ml30%Acrylamide0.544ml1MTris-HCL溶液（PH=6.8）1.02ml10%APS40.82ulTEMD2.04ul配胶方法同上，各种溶液加入到烧杯中，后震荡。灌浓缩胶：用1ml的移液枪将玻璃板中的剩余空间灌满浓缩胶，灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。冰箱过夜待浓缩胶凝固后，取保险膜铺平于桌上，另取两张草纸铺于保鲜膜上。用ddH2O浸湿草纸。取玻璃板放于草纸上，包好。放入4℃冰箱过夜。浓缩胶的浓度比较低（5%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺），里面的孔径也比较大，所有的蛋白都能够在进入分离胶之前在同一水平线上（因为在你加样的时候蛋白是分布在加样孔中的，不在同一水平线上。）分离胶的胶浓度比较大（10%），里面胶孔径也比较小，这样施加电压的时候小的蛋白可以穿过孔跑到下面去，而分子量大的蛋白就可能被拦住，就跑的慢。通过这种方式以分子量大小的区别来分离蛋白质插梳子三电泳：固定：将玻璃板等装置固定在电泳槽内上样：上所需要的蛋白质样品电泳3·1固定①用ddH2O水冲洗一下玻璃板，将其放入电泳槽中。注意，小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。②向电泳槽中加入1x电泳液③拔掉梳子，注意动作轻柔。•5X电泳液缓冲液Tris（MW121.14）15.1g甘氨酸（MW75.07）94gSDS5.00g蒸馏水至1000ml3·2上样蛋白质样品的提取与制备蛋白浓度的测定计算上样量用微量注射器吸取蛋白加入到上样孔中。一般蛋白MARK的上样孔在两边。3·1·1蛋白样品制备（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，将瓶倒扣在吸水纸使其吸干培养液。2、向培养皿中加入裂解液，通常6孔板150-200ul/孔，12孔板50-60ul/孔，冰上放置，摇床20min3、用勺子刮下细胞，并吸出液体至1.5ml离心管中，勺子在处理不同样本前清水洗净、擦干（注意冰上操作）4、于4℃下12000rpm离心5min。5、将离心后的上清分装转移倒1.5min的离心管中放于-80℃保存。（2）组织中总蛋白的提取：1.将200mg组织块剪碎，置于1ml裂解液中（5ml离心管）。2.匀浆器进行匀浆，注意冰上操作，匀浆后置于冰上。3.10，000g,4℃,10min,（5ml管）离心4.取上清至1.5ml管，12，000g,4℃,60min,离心5.取上清至新1.5ml管,-80℃储存3·1·2蛋白样品浓度的测定方法定氮法双缩脲法Folin-酚试剂法紫外吸收法考马斯亮蓝法BCA法1.Bradford法简介原理：考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比。制作标准曲线（插入表格）检测样品蛋白含量：取一管考马斯亮蓝+95l0.15mol/LNaClNaCl溶液+5l待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入比色杯中测试。2.BCA法简介实验试剂:BCA试剂，标准蛋白质溶液试验方法:根据吸光值可以推算出蛋白浓度。实验操作:绘制标准曲线原理：BCA(bicinchoninincacid二辛可宁酸)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。3·1·3蛋白上样量的计算取含有提取好的蛋白的EP管，放在冰上融化，计算上样量。可计算含50-100ug蛋白的溶液体积即为上样量（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）取出样品至EP管中，加入1×上样缓冲液至相同的上样体积（上样总体积一般不超过30μl）。上样前要将样品于沸水中煮5-10min使蛋白变性。4X上样缓冲液1.0mol/LTris·HCl（pH6.8）2mlSDS0.8g溴酚蓝0.04g甘油4ml去离子水定容至10ml。混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。使用时稀释成1X。3·1·4上样上样(注意：最外两泳道易跑歪，尽量不用。)Marker6μl（Marker加在最边上的加样孔中）样本20-30μl实验所用Marker电泳后出现10条带：10，15，25，35，40，55，70，100，130，170KDa根据分子量的大小确定电压和时间，marker跑开后变压，一般溴酚蓝离胶下１cm停止电泳进行转膜（一般要让目的条带跑过分离胶的1/3比较好）主要目的是确定靶蛋白的分子量大小；使用预染的Marker还可以实时检测电泳分离情况，并可以转移到膜上。蛋白质MarkerPrestainedproteinladdersUnstainedproteinladdersFermentas上样缓冲液Loadingbuffer显示电泳进程其中甘油可以增大样品密度，使样品沉降到点样孔上，防止样品漂出上样Anode-内槽缓冲液带有负电荷，与凝胶顶部接触外槽中缓冲液带有正电荷，与凝胶底部接触Cathode+带有负电荷的蛋白质从上到下运动（负极到正极），分开电泳进程可以根据前沿指示剂来确定，等其跑到底部上面1cm左右即可停止电泳小分子量蛋白跑的比较快.蛋白根据分子量大小分开蛋白质带有负电荷，因此电泳时可以从负极向正极移动标本加入到上样孔中四转膜准备物品：转移槽黑红夹子NC膜滤纸海绵垫转膜缓冲液（1）转一张膜需准备6张滤纸和1张NC膜。切滤纸和膜时一定要戴手套。将切好的NC膜和滤纸置于1X转模缓冲液浸湿。•10X转膜缓冲液甘氨酸（MW75.07）151.1gTris（MW121.14）30.3g蒸馏水至1000ml溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至20%（2）夹子黑的一面：海绵-3张滤纸-胶-NC膜-3张滤纸-海绵①将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫。在垫子上垫三层滤纸，固定滤纸,擀去其中的气泡。②刮去玻璃板上的浓缩胶，小心剥下下层胶，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将NC膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。膜盖下后不可再移动。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在1X转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。③将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用100V转移1.5h。实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间④不同的转膜装置，转移效率是不一样的，所以换用转膜装置，最好再摸个条件；转膜时电极方向注意是膜正胶负。五封闭准备物品：封闭液BSA（5%脱脂牛奶)摇床1x洗膜液1转完膜后，关闭电源。取出转膜槽，拿出夹子，取膜。2取已经配制好的封闭液（5%脱脂牛奶)，加入到容器中。用镊子将膜的一角夹起，放入到封闭液（5%脱脂牛奶)，注意使转有蛋白的一面朝上。放置在摇床上封闭2-3h或过夜。根据蛋白Marker的标记，切出目的蛋白的条带和内参蛋白的条带。1XTBST缓冲液10XTBS缓冲液100ml蒸馏水900mlTween-201ml因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。溶解后室温保存。封闭液BSA（5%脱脂牛奶)：1XTBST缓冲液95-100ml脱脂奶粉/BSA5g溶解后4℃保存，可于一周内使用。六抗体的孵育一抗的孵育准备物品：目的蛋白一抗内参蛋白（GAPDH，beta-actin或beta-tubulin）一抗摇床①将一抗用封闭液稀释至适当浓度（目的蛋白GluT31:300,actin1:2000）；将膜蛋白面朝上放于槽中，加入抗体②放在摇床上室温下孵育1-2h或过