第三章：病毒感染力的滴定

第三章病毒感染力的滴定半数致死量LD50（50%lethaldose）半数鸡胚感染量EID50(egg50%infectivedose)半数细胞培养物感染量TCID50（tissueculture50%infectivedose)蚀斑形成单位（plaqueformingunit，PFU）测定病毒感染力的方法:一、病毒TCID50的测定操作步骤在青霉素瓶中将病毒作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度作8孔，每孔接种100µl。在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到3×105个/ml。设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法TCID50的计算方法CalculationofTCID50•UseofReed&Muenchmethod(if50ulofvirusdilutionisaddedtoeachwell)病毒液CPE孔数无CPE累计出现CPE孔稀释度孔数CPE孔数无CPE孔数所占的%10-180270100（27/27）10-280190100（19/19）10-37111191.6（11/12）10-4354640（4/10）10-5171130.7（1/14）10-6080210（0/21）Reed-Muench两氏法距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）＝（91.6-50）/（91.6-40）＝0.8lgTCID50=距离此例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数=0.8×(-1)+(-3)=-3.8TCID50=10-3.8／0.1mlKarber法病毒液稀释度出现CPE孔的比率10-18/8=110-28/8=110-37/8=0.87510-43/8=0.37510-51/8=0.12510-60/8=0lgTCID50=L-d(s-0.5)L:最高稀释度的对数D：稀释度对数之间的差S：阳性孔比率总和lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5)=-3.875TCID50=10-3.875/0.1ml二、病毒蚀斑技术病毒蚀斑（plaque)又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。原理：适当稀释的病毒悬液接种经长成单层的敏感细胞后，在覆盖的固体或半固体介质（琼脂糖、甲基纤维素）的作用下，病毒在最初感染的细胞内增殖后，只能进而感染并破坏临近的细胞，经过几个增殖周期后，形成一个局限性的肉眼可见的病变细胞区，即局限性的病灶。plaquesProcedures操作步骤将敏感细胞在平皿或6孔板内培养成单层吸弃培养液，加入含钙、镁的PBS（pH7.4）洗1-2次。用维持液将病毒液作连续10倍的稀释，选择适当稀释度的病毒悬液接种培养孔内的单层细胞，接种量约为原培养液的1/10-1/5，以覆盖住细胞单层为宜，每个稀释度接种2-3孔。将培养板置37℃5%CO2培养箱吸附1h，吸弃病毒液，用含钙、镁的PBS（pH7.4）洗3次。取1.6%-2%的低熔点琼脂糖，融化后降温至38-42℃，与等量预热至38-42℃含6%-10%犊牛血清的无酚红DMEM混合，注入细胞培养板中。室温放置直至琼脂糖凝固，或于4℃冰箱放置几分钟至琼脂糖凝固，然后于37℃5%CO2培养箱继续培养。每天于显微镜下观察细胞病变情况。出现空斑后（2-3天），用含钙、镁的PBS将0.1%的中性红贮存液10倍稀释后滴加到细胞培养板上。于37℃5%CO2培养箱中作用1h，吸弃染液，继续于温箱中培养2-3h。TK-突变株与野毒形成的空斑的比较如果是测定PFU，则直接记取一定稀释度的病毒所形成的空斑数，然后根据公式计算PFU。如果是作病毒纯化•挑取空斑于200μL维持液中，反复冻融3次，接种于PK-15细胞已长成单层的24孔细胞培养板，再于37℃5%CO2培养箱培养至完全发生病变。•一般的毒种纯化：收集病变的细胞悬液，测定TCID50，然后选TCID50较高者再作几轮空斑纯化，获得高滴度的病毒，扩大培养后作种用。•筛选重组病毒：收集病变的细胞或病毒悬液，通过PCR或其它方法进行鉴定，取阳性者再作下一轮空斑纯化。如此3-5轮空斑纯化后即可得到纯化的病毒粒子。噬斑技术的应用：用于病毒纯化：挑选病毒的克隆株测定病毒悬液中感染病毒的含量噬斑形成单位（plaqueformingunit,PFU）概念：每毫升病毒悬液中所含的蚀斑数，即病毒悬液中的感染性病毒浓度。计算方法：如用PRV接种PK-15细胞，每孔接种了0.4ml，结果10-5孔形成了208个空斑，而10-6孔形成了22个空斑，则该病毒在PK-15细胞上的空斑形成单位（PFU）为：22×106/0.4ml=5.5×107个/ml。