酶的生产

项目二酶的生产◈酶的生产方法※提取分离法：直接从动植物或微生物内利用化学等手段提取酶。如胰蛋白酶直接从胰脏中提取，木瓜蛋白酶直接从木瓜中提取。※生物合成法：经过预选设计，通过人工操作控制，利用细胞（包括微生物细胞、动植物细胞）的生命活动产生人们所需要的酶的过程，称为酶的发酵法生产。※化学合成法：按照酶的化学结构中氨基酸或者核苷酸的排列顺序，通过化学反应将一个一个的单体连接起来而获得所需酶的技术过程。酶的生物合成法生产3动物细胞培养产酶微生物发酵产酶1植物细胞培养产酶2微生物发酵产酶5提高酶产量的措施培养基的配制2产酶工艺条件及其调节控制4细胞的选择1酶生物合成的模式76案例分析发酵方法的选择3（1）酶的产量高；（2）易于培养和管理；（3）产酶性能稳定；（4）利于酶产品的分离纯化；（5)安全可靠◈优良产酶细胞应具备的条件※微生物生长繁殖速度快，整个酶的生产周期可以缩短，酶产量可以无限的扩大。※微生物的种类繁多，同一种微生物在不同的条件下，其生长代谢的机制也不相同，那么涉及到的各种酶也就不相同，这就为各种各样的酶的生产提供了基础。例如：同样是微生物发酵生产Lys，在大肠杆菌中Lys的合成途径与谷氨酸棒杆菌Lys的生物合成途径有很大的差异，所以可以利用不同的微生物分别生产不同的酶。◈微生物发酵生产占主导地位的原因：•目前投入工业发酵生产的酶约有50-60种。实际上酶的生产菌种十分广泛，包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌（见表）.目前主要商品酶制剂及其来源酶制剂来源а-淀粉酶黑曲霉、米曲霉、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、麦芽、猪胰β-淀粉酶黑曲霉、小麦、山芋、蜡状芽孢杆菌、变株等芽孢杆过氧化氢酶生机青霉、溶壁小球菌、牛肝、辣根目前主要商品酶制剂及其来源葡萄糖氧化酶黑曲霉、生机青霉、尼崎青霉半纤维素酶黑曲霉橙皮苷酶黑曲霉菊粉酶假丝酵母、曲霉属脂肪酶黑曲霉、米曲霉、圆柱状假丝酵母、根毛霉、无根毛霉、小球菌、类地青霉、胰脏、山羊舌腺等转化酶啤酒酵母、糖化酵母溶菌酶鸡卵清目前主要商品酶制剂及其来源柚苷酶黑曲霉、洋葱曲霉、米根霉、葡萄孢霉、白腐梭霉、木盾壳霉果胶酶黑曲霉、米曲霉、蜜蜂曲霉、地衣牙孢杆菌、枯草杆菌、嗜碱芽孢杆菌、热解蛋白芽孢杆菌、根霉、木瓜、无花果、菠萝、猪胰、猪胃膜普鲁蓝酶致热芽孢杆菌、产气气杆菌木聚糖酶里氏木霉凝乳酶小牛胃、微小根霉、米赫根毛霉、蜡状芽孢杆菌目前主要商品酶制剂及其来源纤维素酶木霉（主要是里氏木霉）、绳状木霉右旋糖苷酶淡紫青霉、绳状青霉、毛壳霉а-半乳糖苷酶葡萄色被孢霉、黑曲霉、米曲霉、假丝酵母、乳酸杆菌等芽孢杆菌β-葡聚糖酶黑曲霉、曲霉属、枯草杆菌、青霉糖化酶黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、根霉葡萄糖异构酶米苏里游动放线菌、二球状节杆菌、凝结芽孢杆菌、树枝状黄杆菌、橄榄色产色链霉菌、白色链霉菌、鼠灰色链霉菌、锈赤色链霉菌目前工业用主要酶的生产菌来源微生物类别菌名产生的酶用途所用菌号分离筛选来源细菌枯草杆菌淀粉酶纺织部门脱浆、酒精厂淀液化S17，厨房空气中分离S56，马铃薯中分离枯草杆菌蛋白酶生丝脱胶S114大肠杆菌L-天门冬酰胺酶治疗白血病AS1.357目前工业用主要酶的生产菌来源微生物类别菌名产生的酶用途所用菌号分离筛选来源细菌异型乳酸杆菌葡萄糖异构酶由葡萄糖制果糖D-80,酸泡菜中分离短小芽孢杆菌碱性蛋白酶皮革脱毛209，河南省平顶山制革晒生皮场地的土壤中分离产气气杆菌异淀粉酶分解支链淀粉，支点的а-1，6-葡萄糖苷键，产物为直链淀粉与糊精，与β-淀粉酶协同作用，能降低β-界限糊精，显著提高β-淀粉酶酶解程度10016目前工业用主要酶的生产菌来源微生物类别菌名产生的酶用途所用菌号分离筛选来源细菌大肠杆菌青霉素酰化酶制取新青霉素的母核6-氨基青霉素烷酸（6-APA）AS1.76枯草杆菌蛋白酶皮革脱毛，胶卷回收，酱油酿造S1.398枯草杆菌蛋白酶酒精发酵，啤酒酿造，葡萄糖生产，洗涤剂，糊精制造，纺织品脱胶，香料加工等JD32BF7658目前工业用主要酶的生产菌来源微生物类别菌名产生的酶用途所用菌号分离筛选来源霉菌点青霉葡萄糖氧化酶食品加工、试剂AS3.3871,自北京土壤分离得到橘青霉5’-磷酸二脂酶水解核酸生产四种5’-单核苷，医院，食品助鲜剂AS3.2788河内根霉淀粉葡萄糖苷酶酿酒厂糖化AS3.8666酒曲中分离目前工业用主要酶的生产菌来源微生物类别菌名产生的酶用途所用菌号分离筛选来源霉菌日本根霉淀粉葡萄糖苷酶制葡萄糖AS3.8666酒曲中分离红曲霉黑曲霉葡萄糖淀粉酶酸性蛋白酶制葡萄糖毛皮软化，啤酒澄清，医药，羊皮染色AS3.976AS3.350土褐曲霉蛋白酶制蛋白胨，皮革脱毛，毛皮软化AS3.374目前工业用主要酶的生产菌来源微生物类别菌名产生的酶用途所用菌号分离筛选来源酵母解脂假丝酵母脂肪酶绢丝原料脱脂，洗涤剂，医药，乳品增香AS2.1203,绢纺废物中得到放线菌转化微白色放线菌蛋白酶皮革脱毛166产酶菌种要求必须符合如下条件：–不是致病菌、在系统发育上最好是与病原体无关;–能够利用廉价原料，发酵周期短，产酶量高；–菌种不易变异退化，不易感染噬菌体；–最好选用产生胞外酶的菌种，有利于菌的分离，回收率高。此外，在食品和医药工业上还应考虑安全性问题。★此外，1977年联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）的食品添加剂专家联合委员会（JEFA）就有关酶生产安全问题向21届大会提出如下意见：•凡从动植物可食部分组织或食品加工传统使用的微生物生产的酶，可作为食品对待，无须进行毒物学的研究，而只需建立有关酶化学与微生物学的详细说明即可。•凡由非致病的一般食品污染微生物所制取的酶，需作短期的毒性实验。•是由非常见微生物制取的酶，应作广泛的毒性实验，包括慢性中毒在内。新开发的酶规定如下表所示各项检查：食品酶制剂毒性实验顶目试验动物急性中毒鼠、大白鼠1、口服4周大白鼠12个月狗2、致癌实验24个月两种啮齿类食品酶制剂毒性实验3、畸胚组织发生试验24个月两种啮齿类4、生产菌病原性试验四种动物5、皮肤刺激性试验（肤、眼）兔子、人6、抗原性美国同意使用的食品用酶及生产菌种菌种酶黑曲霉（A.mger)а-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、乳糖酶、果胶酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶米曲霉(A.oryzae)а-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、乳糖酶、果胶酶、脂肪酶米根霉(Rh.oryzae)а-淀粉酶、糖化酶、、果胶酶、雪白根霉(Rh.niveus)糖化酶紫红被包霉(Morterellavinaceae)蜜二糖酶粟疫霉(Endothiaparasitica)凝乳酶微小毛霉(M.pusillus)凝乳酶菌种酶米赫毛霉(M.miehei)凝乳酶、脂肪酶、酯酶面包酵母(S.cerevisia)转化酶克氏乳酸杆菌(Klnyveyomyceslactis)乳糖酶链霉菌(St.rubiginosus)葡萄糖异构酶米苏里游动放线菌(A.missourensis)葡萄糖异构酶橄榄色产色链霉菌(St.olivochromogenes)葡萄糖异构酶橄榄色链霉菌(St.olivaceus)葡萄糖异构酶美国同意使用的食品用酶及生产菌种菌种酶树枝状黄杆菌(Flavobcateriumarborescens)葡萄糖异构酶枯草杆菌(B.licheniformis)а-淀粉酶、蛋白酶地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)а-淀粉酶凝结芽孢杆菌(B.coagulans)葡萄糖异构酶环状二形节杆菌(A.globiformis)葡萄糖异构酶蜡状芽孢杆菌(B.cereus)凝乳酶溶壁微球菌(M.lysodeikticus)过氧化氢酶动植物菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、胃蛋白酶、过氧化氢酶、溶菌酶、淀粉酶美国同意使用的食品用酶及生产菌种酶制剂的安全检查项目限量重金属铅砷黄曲霉毒素活数计（菌数/g)大肠杆菌（个/g)绿脓杆菌(个/g)霉菌（个/g）沙门氏菌（个/g）大肠杆菌样菌（个/g)40mg/kg10mg/kg3mg/kg不准含有5×104不准含有不准含有100不准含有30∆培养基成分C源：碳素是菌体成分的主要元素，是细胞贮藏物质和各种代谢物的骨架，还是能量的主要来源。酶制剂生产上使用的菌种大都是利用有机碳的异养型微生物。有机碳主要来源：一是农副产品中如甘薯、麸皮、玉米、米糠等淀粉质原料及其水解物；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉质资源。此外，目前研究以石油产品中12-16碳的成分等作碳源.如以某些嗜石油菌生产蛋白酶、脂酶均已获得成功N源：供体内各种含氮物质，如氨基酸、蛋白质、核苷酸、核酸等的组成成分。氮源2种：（1）有机态氮：主要是各种蛋白质及其水解产物。如酪蛋白、豆饼粉、花生饼粉、菜籽饼、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、蛋白水解液、多肽、氨基酸等。（2）无机态氮：是各种含氮的无机化合物。如氨水、（NH4）SO4、NH4Cl、NH4NO3和（NH4）3PO4等。N源：不同细胞对氮源有不同的要求，一般情况：动物细胞要求氨基酸、蛋白胨等有机氮源；植物细胞主要使用铵盐、硝酸盐等无机氮源。微生物细胞中，异养性细胞要求有机氮源，自养型可以采用无机氮源。一般微生物使用混合氮源。N源：使用无机氮源时，铵盐和硝酸盐的比例对细胞生长代谢有显著影响。C/N比：通过测定培养基中碳素和氮素的含量而得；有时用所含碳源总量和氮源总量之比表示；二者算法差异有时很大，用时要注意。无机盐主要是P、S、K、Mg、Ca、Na盐等。一般采用添加水溶性的硫酸盐、磷酸盐、盐酸盐或硝酸盐等。细胞的组成元素酶的组成元素酶的激活剂调节酶活性对pH、氧化还原电位、渗透压起调节作用微量元素主要有Fe、Mn、Zn、Cu、Co、Mo等。有些微量元素在水中已经足量，不必再加。生长因子：微生物还需一些微量的像维生素一类的物质，才能正常生长发育，这类物质统称生长因子（或生长素）。其中包括某些氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶类等。酶制剂生产中的生长因素大都由天然原料中提供，如玉米浆中含有生长素32-128mg/mL。麦芽汁、豆芽汁、酵母膏等。目前广泛应用玉米浆。产酶促进剂：于培养基中添加某种少量物质，能显著提高酶的产率，这类物质叫产酶促进剂。大体上分为两种：一是诱导物二是表面活性剂。如吐温-20的浓度为0.1%时，能增加许多酶的产量。表面活性剂可能是：（1）增加细胞的通透性；（2）改善氧的传递速度；（3）保护酶活性。通常用非离子型表面活性剂如聚乙二醇、聚乙烯醇衍生物、植酸类、焦糖、羧甲基纤维素、苯乙醇等。离子型的表面活性剂对微生物有害，同时表面活性剂还必须对人、畜无害。在设计和配制培养基时，首先要根据不同细胞和不同用途的不同要求，确定各组分的种类和含量，并要调节所需pH，以满足细胞生长、繁殖和新陈代谢的需要。微生物培养基中，碳源一般采用淀粉或其水解产物，氮源一般采用混合氮源，无机盐和生长因子则根据需要而添加。∆☞按照微生物培养基形态1.固体法酶的生产：将微生物菌种接种在固体培养基上（以麸皮、米糠等为主要原料），先拌入适当水或加入含有Zn2+、Fe2+、Co2+、Mg2+等微量元素的水溶液，以蒸气灭菌后凉至30℃左右，拌入种曲后，装入盘或帘子上，摊成薄层（厚约1cm左右），在培养室内一定温度和湿度（RH90-100%）下进行培养。逐日测定酶活，到活力不再增加，停止发酵，进行酶提取。这种固体培养物称为“麸曲”。在培养过程中，由于呼吸发热需进行“扣盘”，将甲盘翻入乙盘，盘为木制或底部带有小孔的铝盘或不锈钢盘。50×65cm，高5cm，每盘可装麸曲1kg。用于α-淀粉酶、蛋白酶、乳糖酶、木霉的纤维素霉、黑曲霉的果胶酶等。发酵方法1.固体法酶的生产：优点：（1）设备投资少，易于上马，适合于中小型企业。（2）生产管理要求不高，对于培养过程中的无菌程度要求也不高，这就相应的降低了生产成本。（3）单位产品的酶活力较高。缺点：（1）无菌程度较低，生产的酶制剂大部分是水解酶类，而且往往只适合于混合物的水解。（2）发酵周期较长，通常需要4-5天。（3）生产过程中工人的劳动强度较大。2.液体法