微生物的生长及其控制

第六章微生物的生长及其控制概论生长：细胞物质不可逆地增加，体积增大的过程。（量变过程）繁殖：生命个体数量增加的过程。（质变过程）群体生长：指在一定时间和条件下细胞数量的增加；实质上包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程。群体生长=个体生长+个体繁殖个体生长→个体繁殖→群体生长单个微生物细胞合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。同化作用的速度超过了异化作用个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加。群体内各个个体的进一步生长群体的生长第一节测定生长繁殖的方法一、测生长量：单位时间里微生物重量上的变化（一）直接法（精确的称干重法；粗放的测体积法）（二）间接法（比浊法，生理指标法）将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来，然后烘干（干燥温度可采用105℃、100℃或80℃）、称重。一般干重为湿重的10%～20%，而一个细菌细胞一般重约10-12～10-13g。该法适合菌液浓度较高的样品。（一）直接法（二）间接法1.比浊法：借助于分光光度计，在一定波长（450-650nm波段)下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。原理：在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。特点：快速、简便。浊度仪2.生理指标法测含氮量：蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。其他方法：含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产CO2、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。二、计繁殖数：单细胞微生物细胞个体数目的检测法1.直接法：(1)计死活总菌数：显微镜下计数(2)死活菌分别计数：酵母：美蓝染色，活细胞无色，死细胞蓝色细菌：丫啶橙染色，活细胞有橙色荧光，死细胞发绿色荧光细胞密度＝（4个大格细胞总数/4）×104个/ml2.间接法：是一种活菌计数法(1)平板菌落计数：好氧菌、厌氧菌均可（实验）菌样稀释→浇注平板→倒置培养→统计菌落形成单位cfu→乘以稀释倍数→菌样含菌数用活菌指示剂TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)可使菌落在短时间内形成玫瑰红色——快速鉴定(2)厌氧菌的菌落计数法亨盖特滚管培养法和半固体深层琼脂法第二节微生物的生长规律一、微生物的个体生长和同步生长1、同步培养（synchronousculture）：即设法使群体中的所有细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂同期中，然后分析此群体的各种生物化学特征，从而了解单个细胞所发生的变化。2、同步生长（synchronousgrowth）：通过同步培养而使细胞群体处于分裂步调一致的生长状态，称同步生长。方法：①环境条件诱导法：氯霉素抑制细菌蛋白质合成；细菌芽胞诱导发芽②机械筛选法：过滤法；离心法；膜洗脱法二、单细胞微生物的典型生长曲线1、典型生长曲线：生长曲线：定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线。典型生长曲线：将菌种接种在液体培养基中隔一定时间取样，计算菌数，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标作图，绘出一条包括延滞期、指数期、稳定期和衰亡期四个阶段的曲线。R(生长速率常数)=分裂次数(代)/单位时间（一）延滞期（lagphase）或停滞期--“万事开头难”1.特点：细胞数目不增加(R=0)细胞长、大细胞内RNA尤其是rRNA含量增高合成代谢旺盛，诱导酶迅速合成对不良条件敏感2.影响延滞期长短的因素菌种接种龄：即“种子”的群体生长年龄，即处在生长曲线上的哪一个阶段。接种量：接种量的大小明显影响延滞期的长短。培养基成分：接种到营养丰富的天然培养基中的微生物，要比接种到营养单调的组分培养基中的延滞期短。种子损伤度3.产生原因①接种后，新的培养基与原来的培养基成分不同，细胞需要时间合成新的酶来利用新的营养物质；②接种后，细胞内的一些关键小分子、离子或酶由于稀释作用导致浓度下降，恢复到原来水平需要时间；③种子较老，缺乏ATP，必需的辅助因子及核糖体；④细胞可能受损伤而需要一段时间恢复。（二）指数期（exponentialphase）或对数期1.特点：生长速率常数最大，繁殖数死亡数细胞每分裂一次所需的时间——代时（generationtime，G，增代时间）或原生质增加一倍所需的倍增时间（doublingtime）最短。细胞平衡生长，成分均匀酶系活跃，代谢旺盛。2.三个重要参数一些细菌的代时菌名培养基培养温度代时E.coli（大肠杆菌）肉汤37℃17minE.coli牛奶3712.5Enterobacteraerogenes（产气肠细菌）肉汤或牛奶3716~18E.aerogenes组合3729~44B.Cereus（蜡状芽孢杆菌）肉汤3018B.thermophilus（嗜热芽孢杆菌）肉汤5518.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳杆菌）牛奶3766~87Streptococcuslactis（乳酸链球菌）牛奶3726S.lactis乳糖肉汤3748Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌）葡萄糖25344~46Mycobacteriumtuberculosis（结核分枝杆菌）组合37792~93Nitrobacteragilis（活跃硝化杆菌）组合2712003.影响指数期微生物代时长短的因素菌种：代时随菌种而异营养成分营养物浓度：营养物在低浓度时影响菌体的生长速率，在高浓度时影响菌体的生长量。凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的某营养物，称生长限制因子。培养温度4.对数生长期的意义①研究代谢和生理性能的好材料；②生产中用其作种子；③增殖噬菌体的最佳宿主（三）稳定期（stationaryphase）或恒定期1.特点：细胞数目不增加(R=0)，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。菌体产量达到了最高点，而且菌体产量与营养物质的消耗间呈现出一定的比例关系。2.稳定期到来的原因主要是：营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物的比例失调，如C／N比值不合适；酸、醇、毒素或H20等有害代谢产物的累积；pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜。3.稳定期的意义①若以生产菌体或次级代谢物为目的，稳定期是最佳收获期。②对生物测定来说，稳定期是最佳测定时期。（四）衰亡期（declinePhase或deathPhase）1.特点：个体死亡的速度超过新生的速度(繁殖数死亡数)，整个群体就呈现出负生长（R0）细胞形态多样，例如会产生很多膨大、不规则的退化形态有的微生物因蛋白水解酶活力的增强就发生自溶有的微生物在这时产生或释放对人类有用的抗生素等次生代谢产物在芽胞杆菌中，芽胞释放往往也发生在这一时期2.产生原因营养物质耗尽、有毒代谢产物的大量积累、理化环境的不利。分解代谢速度合成速度，大量菌体死亡。生长特点成因菌体特征应用及其它调整期对数期稳定期衰亡期不立即繁殖繁殖速度最快出生率等于死亡率,活菌数最大,代谢产物大量积累死亡超过繁殖适应新环境条件适宜生存条件开始恶化生存条件极度恶化代谢活跃,体积增长较快个体形态和生理特性稳定有些种类出现芽孢出现畸变与菌种和培养条件有关生产用菌种科研材料改善和控制条件,延长稳定期细胞裂解释放产物单细胞微生物生长的四个时期三、微生物的连续培养连续培养（continuousculture）又称开放培养（openculture），是相对于上述绘制典型生长曲线时所采用的单批培养（batchculture）或密闭培养（closedculture）而言的。单(分)批培养：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。连续培养：当微生物培养物进入对数期或稳定期后，连续供给其新鲜培养液，同时不断地移出多余的培养液和代谢产物，从而使微生物始终处于较适宜的条件下生长繁殖，这种方式叫连续培养。单批培养恒浊法恒化法单批培养连续培养时间连续流入新鲜培养液lg细胞数（个/ml）连续培养原理：通过认识稳定期到来的原因，并采取相应的有效措施：反“稳定期”的到来。连续培养器的类型恒浊器（turbidostat）这是根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，使细菌培养液浊度保持恒定的微生物细胞的连续培养器。在恒浊器中的微生物，始终能以最高生长速率进行生长。不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定恒化器（chemostat或bactogen）：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖的一种连续培养装置。这是一种通过控制某一种营养物（如碳、氮源；生长因子；无机盐等）的浓度，使其始终成为生长限制因子的条件下达到的。保持恒定的流速,使营养物质浓度保持恒定装置控制对象培养基培养基流速生长速率产物应用范围恒浊器菌液密度（内控制）无限制生长因子不恒定最高速率大量菌体或与菌体生长平行的代谢产物生产为主恒化器培养液流速（外控制）有限制生长因子恒定低于最高速率不同生长速率的菌体实验室为主恒化器与恒浊器的比较和单批培养相比，连续培养的优点有：①高效：减少设备清洗、准备和灭菌等非生产时间，提高了设备利用效率②便于自控③产品质量相对稳定连续培养法的缺点：①需要专门仪器，投资高②由于是开放系统，加上反应周期长，容易染菌③在长周期连续培养中，菌种易于退化④营养物的利用率一般低于单批培养新加入的培养基与原有的培养基不易完全混合，影响培养和营养物质的利用四、微生物的高密度培养（highcell-densityculture,HCDC）指微生物在液体培养基中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。现代高密度培养技术主要是用于基因工程菌生产多肽类药物。高密度培养的方法主要有：•选取最佳培养基成分和各成分含量•补料•提高溶解氧的浓度•防止有害代谢产物的生成•保持合适pH第三节影响微生物生长的主要因素影响微生物生长的外界因素很多，除了营养因素之外，还有许多理化因素，如：O2、温度、pH值、水活度、渗透压、辐射、UV、电离辐射、超声波、化学药剂等。一、温度温度对微生物的影响具体表现在直接影响细胞内的各种生化反应：影响酶活性：温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。影响细胞膜的流动性：温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输。影响物质的溶解度，对生长有影响。最低生长温度：一般在-10℃～-5℃，极端的可达-30℃。最适生长温度最高生长温度：一般80-95℃，极端的105-150℃。最适生长温度：某菌分裂代时最短、生长速率最高的温度。嗜冷菌：20℃中温菌：20-45℃嗜热菌：45℃生长温度的三基点对于同一微生物来说，其不同的生理生化过程有着不同的最适温度。也就是说，最适生长温度并不等于菌体生长量最高时的培养温度；也不等于发酵速度最高时的培养温度；更不等于积累某一代谢产物量最高时的培养温度。二、氧气1.微生物与O2关系2.厌氧菌受氧毒害机制五类与氧关系不同的微生物在半固体琼脂柱中的生长状态（模式图）三、pH值pH值可影响微生物的生长和改变微生物的代谢产物。pH值对微生物的影响主要作用于：影响细胞膜的电荷分布，从而影响对营养物质的吸收；影响酶的活性，从而影响代谢过程；影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响营养物质的吸收或有毒物质的毒性。不同微生物对pH要求不同微生物的生长pH值范围极广，从pH2--10都有微生物能生长。但是绝大多数种类都生活在pH5.0~9.0之间。微生物生长的pH值三基点：各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。低于最低、或超过最高生长pH值时，微生物生长受抑制或导致死亡。微生物名称pH值最低最适最高Thiobacillusthiooxidans氧化硫硫杆菌0.52.0~3.56.0Lactobacillusacidophilus