流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)

一、开机程序：1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中气压。2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印机。3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以排除管路中气泡。二、运行FACSComp软件、检查仪器状况1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。2.机器预热5min，打开FACSComp软件，选择保持路径。选择所需校正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。3.在软件界面左侧AssaySelection选项中选择质控类型，即实验过程中是否需要清洗样品。4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。7.做Setup。8.打印校正结果，退出FACSComp程序。备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。三、样品分析软件：CellQuestPro1.保证机器预热5min，打开CellQuestPro软件，选择“联机”。（1）在弹出的界面中的选择数据存储路径（Directory菜单）；AcquireConnecttoCytometer（2）对实验样本进行命名；（3）对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。备注：如果界面被关闭，重新调出步骤：2.调出质控模板。3.画图选择画图工具（一般选择散点图），Inspect界面会自动弹出，对几个常用选项进行设定：将散点图选中（用鼠标点击散点图边框才能够选中图形），将改为,更改横纵坐标表示名称，设置十字象限。如果要做四色实验，则绘制四个图。备注：第一个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC。（1）设定获取细胞数目：一般获取10000个细胞。（2）调出电压、阈值和补偿等界面。（3）将所有补偿调为0。（4）将非52的阈值调为0。（5）FSC和SSC一般用线性（Lin）,激光通道（FL1-FL4）一般用对数（Log）。（6）调出细胞计数器：4.上阴性对照将阴性对照管混匀，上机，功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信号，第一个图：让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域；其他三个散点图，要将细胞信号调整到阴性区域，即左下角区域。通过移动通WindowsShowBrowersCytometerInstrumentSettingsOpenBD图标BDFilesInstrumentSettings选择调用的质控文件OpenSet（一定要做）DoneAnalysisAcquireAnalysisAcquireAcquisition&从工具栏Cytometer选项中调出（1,2,3和4）ComplementThreaholdAcquireCounter道电压来实现。获取实验数据：暂停刚才实验注意：在获取细胞之前，要将Setup前面的勾子取消。5.上单阳管，调节功能键“RUN”,如果细胞信号出现在双阳区域，说明有细胞信号露到相邻通道中，要将细胞信号调节到单一通道中。通过移动通道补偿来实现，想要细胞信号向哪个通道移动，就用散点图中的另一个通道去减，即想要移动的那个通道作为减数。如在FL1和FL2两个通道组成的散点图中，细胞信号出现在双阳区域，要将细胞信号移动到FL1通道，就要调节FL2-FL1对应的补偿，直到细胞信号只出现在FL1通道中，这样可以消除漏到FL2通道中的信号。备注：FL1-FITC，FL2-PE，FL3-PerCP，FL4-APC。根据实验要求选择流速，按设置顺序上样。6.点击“Acquire”命令，仪器开始获取数据，并自动将数据文件保存到规定的目录下。7.样本获取完毕，功能键设置在“STANDBY”，并选择“脱机”命令。8.点击“Quit”命令，退出CellQuest软件。9.关机：（1）1%次氯酸，高速（Hi）“RUN”5-10min，Acquire如果细胞计算器中不显示有细胞则表示管道已经干净。（2）用双蒸水高速（Hi）“RUN”5-10min，Standby5min，关机。四、DNA倍性分析实验：一、仪器情况检测，DNA倍性分析的质控用CellQuestPro软件进行。1.（1）保证机器预热5min，打开CellQuestPro软件，选择“联机”。做质控时，需要画三个图，第一个是散点图，横坐标是FSC，纵坐标是SSC；第二个是散点图，横坐标是FL2-Width，纵坐标是FL2-Area；第三个是直方图，横坐标是FL2-Area，纵坐标是Counter。做DNA倍性实验时一般使用PI染色，所以选择用第二通道（FL2）。DNA倍性分析不需要调节补偿。因为属于单色实验，所以把电压界面前的勾去掉。将信号接收方式“Log”改为“Lin”，DDMPram改为“FL2”。阈值使用FL2，而不是FSC。去掉细胞群中粘连体，上样本，利用第二个图，调节FL2-A和FL2-W电压，使细PauseAbortAcquireAcquireConnecttoCytometerFourcolor胞群信号显示在横纵坐标200位置，通常血细胞中单细胞成45℃，粘连体体积会比单细胞大，大概在横坐标400位置。保存质控。二、DNA倍性分析用ModFitLT软件进行。（1）打开ModFitLT软件，调出样品检测结果，（2）选择面积（FL2-A），选定X轴：FL2-W，Y轴：FL2-A。（3）可以点击Auto选项，进行结果自动分析，也可以选择Manuale，人工分析。FACSCalibur每日开机程序1.检查鞘液桶，确认：鞘液充满状态(~3升)盖紧黑盖管路畅通，无扭曲2.检查废液桶，确认：废液桶充满100ml漂白剂管路畅通，无扭曲3.打开流式细胞仪。4.打开电脑。5.气压阀置于加压位置，并排除管路中气泡。6.做Prime。7.等待机器预热5---10分钟后可开始实验。FACSCalibur每日关机程序1.用2ml10%稀释漂白剂(有效氯0.5-1%)作样品，将样品支撑架置于旁位，以外管吸入1ml。2.将样品支撑架置于中位，以HIRUN5分钟。3.将样品换成蒸馏水重复1-2步,时间加倍。4.放置盛有1ml蒸馏水的试管于样品支撑架上。5.选择Standby模式5分钟后可关掉主机。6.退出所有应用软件，在关掉主机之前关闭电脑。