免疫检测的自动化及标准化

免疫检测的自动化及标准化蚌医一附院检验科王凤超免疫分析技术•经典的免疫分析技术凝集反应、沉淀反应、溶血反应、补体结合实验特点：成本低、技术简单、结果易于判断，但不易于实现自动化。•现代的免疫分析技术荧光免疫标记、放射性免疫标记、酶免疫标记、镧系（稀土）元素免疫标记、临床化学免疫分析技术、发光免疫标记、流式免疫微球技术及生物传感器技术等。特点：灵敏、特异、快速、易于测定及实现自动化。荧光免疫标记技术•1950年Coons合成异硫氰酸盐(荧光染料)，用作标记抗体做小鼠组织切片染色，开创了免疫荧光技术（immunofluorescencetechniques）,又称为荧光抗体技术（Fluorescentantibody）•传统免疫荧光技术：荧光显微镜下分析荧光状态、分布，及流式细胞仪，荧光偏振分析•现代免疫荧光技术：荧光激活细胞分类仪（FACS)，荧光自动化分析测试仪、时间分辨荧光技术（TRF)•TRF：以稀土离子(镧系元素）标记抗原或抗体，稀土原子具有荧光发射峰谱范围窄、激发光波长范围宽的特点，有利于增强荧光的特异性，提高分辨率；排除非特异性荧光的干扰、降低本底荧光。具有标记物制备简便、有效期长、不污染环境、操作流程短、标准曲线线性范围宽，高灵敏、高特异、有效期长、易于实现自动化、应用范围广等优点。放射性免疫标记技术•1958年，美国科学家贝尔森和雅洛把放射性“标记”引入免疫分析，两人也因此获得了1977年的诺贝尔生理学奖。早期的研究都是以I131(α射线和γ射线)作为标记的，目前用的是高纯度、高活性的I125(弱γ射线)，以减少放射性核素对人体健康潜在的影响。•优点：高灵敏、高特异•缺点：同位素半衰期及污染问题、试剂有效期短、反应时间长、批间批内的差异、标准曲线稳定性差、不易实现自动化。•从90年代开始放免分析在国际上每年以10％的速度下降。随着时间的推移，将会被新的技术方法取代。磁微粒分离技术•2-3um的超顺磁性磁微粒作为实现免疫反应结合物与反应混合物的分离载体•其核心制造技术是在超顺磁性磁微粒的表面大量偶联了特异性结合抗体•参加反应后的免疫磁微粒通过一个外加磁场吸附下来，然后把其它杂质去掉•免疫反应在反应状态上，相比微孔板式的固相反应(固液界面反应)优化成了准液相反应，反应面积、几率大大增加，其反应速度大大加快。•制备的试剂具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、结果准确可靠的优点•动力粒子:酶免疫标记技术酶免疫标记技术酶免疫测定酶免疫组化技术均相酶免疫测定异相酶免疫测定液相酶免疫测定固相酶免疫测定（ELISA）酶免疫分析的自动化•酶免分析系统的标准化，自动化与网络化，是全实验室自动化（TotalLaboratoryAutomation，TLA)系统的重要组成部分，包括样本(前处理)模块、酶免分析(后处理)模块、软件信息模块等，是迈向全面实验自动化建设的重要基石。酶免疫分析的自动化•样本处理自动化主动标本识别条码阅读功能；更高的标本处理效率;更少的劳动强度;职业暴露机会最小化；通过减少人为失误、改善加样精度与准确性来改善分析质量，采用批量（batch)或随机(randomaccess)进行多种组合与多种模式的检测•全自动酶免分析系统多任务、多通道，完全实现平行过程处理，特别是自由任务资源管理系统，可以随时增加(急诊)任务菜单，实现最优反应过程(实验质量)和最大化分析生产力(throughput)。根据处理模式的不同，全自动酶免分析系统可分为两类，即一体机:如EVOLIS.Alisei.Tecan，PersonalLAB，变色龙等;分体机:如AT和费米；斯达尔和费米;RSP和MPP3000等。MicrolabATplus2增强型全自动样本处理机•采用主动条码识别•12通道加样针•主动抛弃式加样头•容积从10一300ul•96个标本加样速度小于5分钟•可批量处理最多5块微板。FAME(费米)全自动酶免分析系统•硬件上采用综合模块化设计，并行工作模式、双孵育双洗板、单读数模块•可容纳10块板，24个试剂位，30个密闭式孵育位•采用液体水平探测(LLD)、体积与重量传感、光学位置传感等技术，实现了真正的全过程控制(TPC)，尤其是专利的洗液传感器，确保了最佳洗板效果。•软件上采用全自动GMP/GLP规范系统，如全面的系统跟踪记录（Traceability）与系统追溯（Traceability），标本／试剂加样校验(Sarnpleverification)及“自由任务管理”等功能。哈美顿的辉煌之星酶免之星TECAN大型全自动酶免一体机•采用条码识别和试管架定位两种标本识别模式，可调式四维方式运动传输•加样头则使用一次性加样头与TEFLON钢针任意组合•加样速度高达1956孔/小时，试剂分配速度为7680孔/小时•可同时在线20项试验，每块板内分别进行12项试验。恒温孵育器多达2个，每个孵育器至少可容纳6个板•读板速度达6秒/板，4种洗液在线模式，清洗液量系统监控•试剂全开放BRIO开放式全自动酶免系统•中心处理系统为双试剂和样本盘模式，可容纳4块微孔板，120样本，最大运行9项测试。•测试模式可为随机插入式或成批处理式。•双机连机型加样速度达768标本／h，试剂分配速度为2300孔／h•孵育及振荡模式均采用独立控制的孵育及振荡位，温度范围25-45C，具有1°C增量和/或1300rpm振荡。•原采血试管、试剂、缓冲液、清洁液，废液瓶均配有液面自动检测系统。•缺点是读数器（酶标仪）独立于机外。Alisei全自动酶免分析系统•中心处理系统采用独特的滑轮传送模式，内含六块微孔板•具有双针加样系统，共配有4个高精度的注射器，加样速度达700标本/h，试剂分配速度为1900孔/h•系统利用多批次处理方式，每天可处理20块微孔板的不同项目测试，同时在线16个不同项目。•独立的孵育振荡位多达6个，试剂开放•具有时间优化管理功能PersonalLAB全自动酶免分析系统•可同时处理两块酶标板•最多运行6种不同项目192个检测•机械手臂能够根据样本具体情况，选择使用金属针或者一次性的塑料加样头，加样速度小于14分钟(96个样本)，试剂分配速度小于3分钟(96孔)•系统拥有两个独立的封闭式温育仓，一个清洗站和两个读数平台，专利的洗板头为8个加液器和8个吸液器组成•探针的内外双冲洗可最大限度地减少交叉污染。NexgenFour全自动酶免分析系统•双臂四针，可并行运行4块96孔酶标板•系统由1个中央样品装载盘，2套独立三维加样臂、4个独立孵育舱、4×8通道读数器、2套洗板装置组成。•拥有可实时互换的双重加样针(金属加样针和一次性加样头)，并行加样本速度800孔/h，加试剂速度3800孔/h。•该仪器由内、外2套计算机管理，先进的运行软件基干WINDOWSXP和NET架构设计。•仪器还可以增选全自动过敏原分析装置。EVOLIS全自动酶免分析系统•EVOLIS是一个全面开放的全自动酶免系统，内置多种模式的条形码解读功能，用户可任意设置或修改ELISA试验涉及到的所有参数。•可同时处理四块酶联反应微孔板，每板多达12种测试,同时上样180个标本;系统配置八个滤光片同时对多块板进行不同组合的操作•样品和试剂加样针采用一次性加样头•具有液面及血凝/气泡感应检测器；4个独立的孵育盘，3种不同的洗液，灵活多变的微孔板清洗方式变色龙开放式全自动酶免系统•变色龙是一套全自动、开放式，连续、多批次酶免分析系统。高度灵活的加样功能，可在加样针中进行稀释，加样速度9分钟/96孔，加试剂速度为2.5分钟/96孔，可放置188个样品管和预稀释管120个加样用Tips头、8个预稀释液56个对照或标准品。•一次性Tip头和固定加样针自由互选，独有的微孔交叉吸液使残留液减至2ul以下。•独立的温控板位多达4个，可进行独有的振荡式加盖孵育。小结•目前，部分全自动酶免分析系统已具备全过程控制（TPC）系统，符合GMP，GLP硬件和软件规范，可以全自动生成实验操作记录(Traceability)和系统追溯记录(Trackability)，这些技术进步不仅有助于建立信息化的质量控制(QC)和质量保障(QA）体系，而且在医疗责任举证倒置的实践中，这些记录或证据将可以阐明酶免实验的正确性和可靠性，以防患各种纠纷的产生。化学发光免疫测定化学发光免疫测定的分类1发光酶免疫测定（间接化学发光）AP/OH—HPO42—OOOCH3O-光化学发光免疫测定的分类2直接化学发光NCH3COORHO+2-NCH3COORONCH3COOO+光化学发光免疫测定的分类3电化学发光电化学发光•反应原理:化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+和电子供体三丙胺(TPA)在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，这是一种强氧化剂,TPA失去电子后被氧化成阳离子自由基TPA十.，它很不稳定，可自发地失去1个质子(H十)，形成自由基TPA.，这是一种很强的还原剂，可将一个电子给三价的[Ru(bpy)3]3+使其形成激发态的[Ru(bpy)3]2+，。激发态的三联吡啶钌很快发射出一个波长620nm的光子，回复成基态的三联吡啶钌。这一过程可以在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号增强。TPA+TPARu(bpy)3+Ru(bpy)Ru(bpy)2+光子(620nm)●333●*基态激发态美国雅培公司的AXSYM全自动快速酶免疫分析系统•技术原理：MEIA、FPIA、ICIA•标记物：碱性磷酸酶•包被技术：微粒子包被•分离技术：纤维网分离•发光剂：4－MUP•发光诱导：酶催化底物发光•检测方法：夹心法和竞争法•检测速度：70T／h•试剂位：20•灵敏度：10－15•重复性：批内＜5％，批间＜10％美国雅培公司的I2000SR•技术原理：化学发光•标记物：吖啶酯•包被技术：磁微粒子包被•分离技术：磁性分离•发光剂：吖啶酯•发光诱导：改变PH值•检测方法：夹心法和竞争法•检测速度：200T／h•试剂位：25•灵敏度：10－15•重复性：批内＜5％，批间＜10％美国拜耳CS180SE和ACSCENTAUR全自动化学发光免疫分析系统•技术原理：化学发光•标记物：吖啶酯•包被技术：磁微粒子包被•分离技术：磁性分离•发光剂：吖啶酯•发光诱导：改变PH值•检测方法：夹心法和竞争法•检测速度：100T／h•试剂位：13•灵敏度：10－15•重复性：批内＜5％，批间＜10％德国全自动化学发光免疫分析仪LIAISON•技术原理：直接化学发光技术•标记物：异鲁米诺•包被技术：磁微粒子包被•分离技术：磁性分离•发光剂：异鲁米诺•发光诱导：改变PH值•检测方法：夹心法和竞争法•检测速度：180T／h•试剂位：15•灵敏度：10－15•重复性：批内＜5％，批间＜10％VitrosECI全自动增强化学发光酶免分析仪系统•技术原理：增强化学发光技术•标记物：辣根过氧化物酶标记•包被技术：链霉亲和素包被的子弹头型塑料小孔管为固相载体包被•分离技术：直接清洗分离•发光剂：鲁米诺•发光诱导：酶催化底物发光•检测方法：夹心法和竞争法•检测速度：70T／h•试剂位：15•灵敏度：10－15•重复性：批内＜5％，批间＜10％Access2全自动微粒子酶放大化学发光免疫分析系统•技术原理：间接化学发光•标记物：碱性磷酸酶•包被技术：磁微粒子包被•分离技术：磁性分离•发光剂：AMPPD（Dioxetane)•发光诱导：酶催化底物发光•检测方法：夹心法和竞争法•检测速度：80T／h•试剂位：24•灵敏度：10－15•重复性：批内＜5％，批间＜10％UniCelDxI800免疫分析系统•真正24小时待机，50个试剂储存于仪器自备冷藏系统中，每小时400个实验,自动稀释、重检、样本检测项目的随机组合，急诊标本具有优先权力•仪器前部具备一次性上机120个原始管能力，运行状态中可不断循环加入,仪器背部预留自动化轨道进样模式的加样能力•分立的4个进样系统、一体化的整系统检测方式,共享一个检测系统和孵育器、共享一套冲洗、读