旋光光谱和圆二色谱

旋光光谱和圆二色谱旋光光谱（opticalrotatorydispersion，ORD）圆二色谱（circularsichroism，CD）分别于20世纪50年代和60年代发展起来的仪器分析方法，都是利用电磁波和手性物质相互作用的信息来研究化合物的立体结构及其它有关问题。偏振光与手性物质的相互作用旋光光谱圆二色谱康顿效应及ORD、CD和UV间的关系应用注意事项1、光的偏振态（1）自然光与线偏振光（或平面偏振光）普通光源中的原子和（或）分子能够独立发光，所发出的光波中具有各个方向的光矢量，在与传播方向相垂直的平面内，在所有可能的方向上，E的振幅都相等——自然光如果光矢量只在一个固定的平面内，并沿一个固定方向振动——线偏振光或平面偏振光光矢量的振动方向与光的传播方向所构成的平面——振动面一、偏振光与手性物质的相互作用（2）圆偏振光振幅保持不变，而方向周期变化，电场矢量绕传播方向螺旋前进可看成是两个相互垂直的振幅相等、相位差为±π/2的线偏振光的合成＋π/2——对应于右旋圆偏振光－π/2——对应于左旋圆偏振光即圆偏振光中包含着两个频率和振幅相同的左旋和右旋圆偏振光2、偏振光的获得（1）布儒斯特定律入射角为ί0时反射光与折射光相互垂直，此时ί0为布儒斯特角或起偏角，反射光为线偏振光若自然光从空气射到折射率为1.50的玻璃上，起偏角为56.3º，折射角为33.7º。（2）晶体的双折射现象当自然光射入双折射晶体时，两束折射光o和e都是线偏振光，并且它们的振动面通常接近于相互垂直（3）二向色性晶体有些透明晶体不仅具有双折射现象，而且对o光和e光有不同的吸收作用，这种晶体称为二向色性晶体，如电气石晶具有很强的二向色性，硫酸碘奎宁晶体（4）波片——也称波晶片或相位延迟片若让线偏振光的振动面与1/4波片的光轴成45º角，则分解后的o光和e光振幅相等，从晶片的另一表面出射的光则是圆偏振光。3、圆偏振光在手性介质中传播时的特点：（1）左、右旋圆偏振光在手性介质中的传播速度不等，导致透射出的面偏振光与入射角成一α角，表现出旋光。（2）手性介质对两种圆偏振光的吸光强度不同，由它们合成的出射光不再是一个平面的偏振光，而是一个右旋或左旋的椭圆偏振光。二、旋光光谱（ORD）1、当平面偏振光通过手性物质时，偏振面会发生旋转，即该物质具有旋光性，旋转的角度——旋光度2、原理（1）介质为对称结构时，左右旋圆偏振光的传播速度相同，则它们的折射率n相等因n＝c/υc:真空中光速υ:介质中光速Δn=nL-nR=0偏振面保持不变（2）介质为不对称结构时，nL≠nRΔn≠0偏振面发生旋转，随光程增大而增大——旋光现象3、测定仪器4、旋光度：α实比旋光度：[α]D＝(α实/cl)×100通常用钠光D线(≈589.3nm)测量α实l:试样槽厚度（dm）c:100ml溶剂中溶液的g数不同波长的[α]λ(比旋光度)为纵坐标，λ为横坐标可得ORD光谱[Ф]λ:摩尔比旋光度，常用其代替[α]λ[Ф]λ=[α]λ·Mr/100(度·cm2·dmol-1)Mr:待测物质的摩尔质量三、圆二色谱1、手性物质对组成平面偏振光的左、右旋圆偏振光的吸光度不同，即εL≠εR这种现象为圆二色性CD谱：Δε为纵坐标，λ为横坐标[θ]:摩尔椭圆度，常用其代替Δε两者关系:[θ]=3300Δε=3300(εL-εR)2、[θ]的物理意义当平面偏振光通过手性介质时，不仅左、右旋圆偏振光的传播速度不同，而且强度也不同。用箭头的长短代替强度。因而光在传播时，它的矢量和将产生的一椭圆轨道长轴：矢量相位相同时的强度短轴：矢量相位相反时的强度θ：平面偏振光离开样品槽的角度——椭圆度[θ]=θ·M/100lc=3300Δε3、测量装置四、康顿效应(cottoneffect)及ORD、CD和UV间的关系1、在紫外和可见区内无发色团的饱和化合物，则ORD光谱呈现单调下降或上升的曲线，若手性化合物的紫外吸收在仪器测量范围内则出现S型曲线称cotton效应即形成一个峰和一个谷组成的ORD谱线—简单的Cotton效应正Cotton效应：波长由长波向短波移动时，ORD谱由峰向谷变化负Cotton效应：波长由长波向短波移动时，ORD谱由谷向峰变化λk:ORD线与零线相交点振幅：谷至峰的距离摩尔振幅α=([Ф]1-[Ф]2)/100[Ф]1:ORD顶峰处的摩尔旋光度[Ф]2:ORD谷底处的摩尔旋光度2、CD的康顿效应正的康顿效应：Δε或[θ]为正值且有峰的CD曲线负的康顿效应：Δε或[θ]为负值且有谷的CD曲线3、ORD、CD和UV光谱间的关系（1）ORD和CD是同一现象的两个方面，都是光与手性物质作用而产生的。主要目的是研究手性化合物的构型与构象，在该方面两者提供的信息总是等价的。UV反映了光与分子的能量交换。(2)理想情况下：λmax（UV）=λmax(CD)=λk(ORD)实际情况：三者接近，但不一定重合ORD谱和CD谱都可用来测定有特征吸收的手性化合物的绝对构型CD谱：容易解析ORD谱：比较复杂不对称分子某生色团吸收峰的Cottoneffect的正负号与该生色团的手性中心的构型有关联，故可分析分子的绝对构象。ORD摩尔振幅α与CD谱中[θ]或Δε的关系α=0.0122[θ]=40.28Δε1、在立体结构化学研究中的应用对于羰基化合物，特别是环酮类化合物的研究较多，并形成了半经验的“八区律”来推测其立体结构：八个区域的划分如下图所示：五、应用将环己酮按图放好：观察者迎着O=C－的方向即从Y轴的负方向看Y轴的正方向。三个互相垂直的A、B、C平面将环己酮分割为八个区：O＝C－前面的4个区由于取代基很难进入，对cotton效应贡献小，不考虑O＝C－后面的4个区贡献大，其对cotton效应正负号的贡献如下图所示：＋－－＋C1,C2,C6——A面上C2,C6的e键——几乎在A面上C2，C6的a键——分别在下右和下左O，C1，C4——B面上八区律1、位于三个平面上的取代基，对cotton效应贡献为02、位于正负区的取代基效应可以抵消3、取代基的贡献大小与性质有关4、取代基对cotton效应的贡献大小随着与生色团的距离增大而变小2,2’,5-三甲基环己酮为例：b是a的投影图，可看到：C1，C2，C4，C6，C7均处于分割面上，对cotton效应贡献为0C3与C5——抵消，C8与C9——正，所以该化合物应有正的cotton效应例2、天然油脂得一产物为3－羟基－3－十九烷基环己酮，有正的cotton效应，试指出它的构型解：按八区律，S构型应有正的cotton效应，R构型应有负的cotton效应,故该环己酮衍生物为S构型2、生物大分子构型、构象的研究（1）蛋白质或多肽中主要得光活性基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫桥键可产生CD光谱，因而可用于蛋白质二、三级结构和氨基酸微环境的检测。（a）蛋白质CD谱远紫外区：(1)178-250nm–反映肽鍵的CD肽鍵是高度有规则排列的，排列方向决定了肽鍵能级跃迁的分裂情况二级结构不同，其CD位置、吸收强度则不相同(2)α-螺旋：192nm有一正谱带222209有两个负的特征峰β-折叠216nm:负峰185-200nm:正谱带β-转角：206nm有一正谱带左手螺旋的P2结构：有负的谱带近紫外区:(1)250-320nm-处于不对称微环境的芳香氨基酸残基、二硫鍵(2)可作为光谱探针研究它的不对称微环境的扰动(b)研究蛋白质的二级结构通过远紫外CD谱研究蛋白质α-螺旋、β-折叠、β-转角结构的分量(C)研究蛋白质三级结构：——chymotrypsin(allb)——lysozyme(a+b)——triosephosphateisomerase(a/b)——myoglobin(alla)三级结构模型可分为：全α型α-螺旋40%β-折叠5%全β型α-螺旋5%β-折叠40%α+β型：α-螺旋、β-折叠均大于15%，这两种结构在空间是分离的，60%的折叠链是反平行的α/β型：α-螺旋、β-折叠均大于15%，这两种结构在空间上是相间的，60%的折叠链平行排列(d)研究氨基酸残基的微环境：蛋白质中芳香氨基酸残基：色氨酸(Trp)酪氨酸(Tyr)苯丙氨酸(Phe)二硫鍵处于不对称微环境时250-320nm出现CD信号Trp:279,284和291nmTyr:277nmPhe:255,261和268nm二硫鍵:整个近紫外CD谱例：阳离子表面活性剂CPB诱导BSA构象CD光谱的变化Figure3Far-UVCD(a)andnear-UVCD(b)spectraofBSAandBSAinCPB1.BSA;2.BSAin1.010-5mol/LCPB;3.BSAin1.010-4mol/LCPB由远紫外CD谱可以看出α-螺旋β-折叠BSA49%9.8%CPB（第一CMC）78%7.6%CPB（第二CMC）37%10.5%由近紫外CD谱可以看出自然状态下BSA分子的near-UVCD光谱图中在261和268nm处有最小值，在277和284nm处有两个肩峰。当加入CPB后，261和268nm处的椭圆率增加，而280至300nm处的椭圆率降低，表明此时氨酸酸残基周围环境的极性发生了变化，这种变化是由于双硫键桥的不对称性遭到破坏而引起BSA分子三级结构变化的结果。(2)核酸(a)278nm有一强正的cotton效应-对应于碱基的堆积248nm有一弱的负的cotton效应-对应于螺旋性(形)220240260280300320-10-505101520(mdeg)Wavelength(nm)fsDNActDNAZ-form:290nm有一负的cotton效应A-form:280nm有正的cotton效应243nm有负的cotton效应正的强度约为负的强度的3倍(b)典型的DNA构型B-form:277nm有正的cotton效应245nm有负的cotton效应C-form:285nm有正的cotton效应(弱)250nm有负的cotton效应(强)3、诱导园二色谱(1)主客体化合物主体为手性客体为非手性，但有吸收会产生诱导园二色谱例如环糊精与客体相互作用包结-产生诱导园二色谱客体结合在环糊精外部-不产生诱导园二色谱若客体的电偶极矩与环糊精Z轴重合——正cotton效应若客体的电偶极矩与环糊精Z轴垂直——负cotton效应六、实验中几个注意事项用N2除臭氧和氧气；样品的浓度应使其吸光度在0.6—1.2之间，可得到较好的信躁比，对蛋白质来说浓度在0.2mg/mL，池子长度是1mm，池体积是350mL；溶剂和缓冲溶液选择的原则是使样品在测定的波长范围内其吸光度尽量的小（溶剂的吸收表如下）；不能用HCl来调pH，因为在低的UV波段Cl-离子会干扰CD的测定狭缝带宽（SBW）的选择：SBW应保持至少为NBW（被扫描物质的自然带宽）的十分之一；在远紫外一般为2nm；如果NBW不知，可选择不同SBW进行实验；溶剂的吸收表Acceptable:1.PotassiumPhosphatewithKF,K2SO4or(NH4)2SO4asthesalt.2.Hepes,2mM.3.Ammoniumacetate,10mM.Avoid:Tris;NaCl;Anythingopticalactive,e.g.Glutamate