一步一步教你使用NCBI

一步一步教你使用NCBI查找DNA、mRNA、cDNA、Protein、promoter、引物设计、BLAST序列比对等作者：urbest2007-8-1苏州大学生命科学学院一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 2  最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用BLAST进行序列比对……，这些问题在NCBI上都可以方便的找到答案。现在我就结合我自己使用NCBI的一些经历（经验）跟大家交流一下BCBI的使用。希望大家都能发表自己的使用心得，让我们共同进步！我分以下几个部分说一下NCBI的使用：Partone如何查找基因序列、mRNA、PromoterParttwo如何查找连续的mRNA、cDNA、蛋白序列Partthree运用STS查找已经公布的引物序列Partfour如何运用BLAST进行序列比对、检验引物特异性特别感谢本版版主，将这个帖子置顶！从发帖到现在，很多战友对该帖给与了积极的关注，在此向给我投票的（以及想给我投票却暂时不能投票的）各位战友表示真诚的感谢，谢谢各位战友！请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。关于NCBI其他方面的使用也请水平较高的战友给予补充Firstofall，还是让我们从查找基因序列开始。第一部分利用Mapviewer查找基因序列、mRNA序列、启动子（Promoter）下面以人的IL6（白细胞介素6）为例讲述一下具体的操作步骤1．打开Mapviewer页面，网址为：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/index.html在search的下拉菜单里选择物种，for后面填写你的目的基因。操作完毕如图所示：2．点击“GO”出现如下页面：一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 3  3．在步骤二图示的右下角有一个QuickFilter,下面是让你选择的几个复选框，在Gene前面的小方框里打勾，然后点击Filter.出现下图：说明一下：1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。2、下面参考序列给出了三个，是不同的部门做出来的，经我验证，序列有微小的差异，但总体来说基本相同。尽管你分别点击后，序列代码、序列代码等有所差异，但碱基基本一致，不影响大家研究分析序列。现在普遍采用的是最上面的那个序列，这一条是世界范围的生物科学家用计算机合成的一个序列。我也推荐大家使用这个序列。一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 4  4．点击上述三条序列第一条序列（即reference）对应的Genesseq，出现新的页面，页面下方为：5．点击上图出现的“Download/ViewSequence/Evidence”，即下载查看序列等功能，结果如图所示：先对上面这张图做点简要的说明，在SequenceFormat（序列输出格式）后面是一个下拉式选择菜单，默认的为FASTA格式，还有一个是GenBank格式。我推荐大家选择GenBnak格式，因为这个格式提供了很多该基因的信息，而FASTA格式只有基因序列。6．在SequenceFormat后选择GenBank，然后点击下面的Display，目的基因的相关信息和序列就出现在眼前了。点击后如图所示（网页较大，只抓取一小部分以作示范）：一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 5  在上述打开的网页中，你可以看到基因长度，基因序列，以及这个基因是如何被报道出来的等各种信息。你会看到:mRNAjoin(3598..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057,7803..8394)这代表了从基因的3598位开始就是转录区了，即我们常说的mRNA片断，由于内含子的存在，所以mRNA在DNA序列上分成了几段。CDSjoin(3660..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057,7803..7970)CDS代表编码序列，即蛋白编码区是从3660开始的（ATG），由于剪接作用所以CDS区也是不连续的。说到这里，可能很多朋友都已经明白了promoter即启动子区域在哪里了。但我还是再唠叨几句：转录起始位点前面是基因的调控区，启动子区没有明显的位置定义，大家也只是猜测它的大体位置，如果你要研究promoter区的话，建议你选择转录起始位点前的2000个碱基进行研究，一般默认的是这样。当然你如果觉得长度太长不好研究的话，也可以只研究-1000到0这一千个碱基，因为一般情况下，启动子区的变异都在这个区域内。这样大家就可以找到自己的目的基因序列和启动子了，这种方法可能使用的人不是很多，但我个人比较喜欢，因为它最大的优点是可以找到启动子区域和其他调控区域。希望大家可以发帖交流，让我们把NCBI用的更好！一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 6  第二部分如何查找连续的mRNA、cDNA、蛋白序列（依然以人类的IL6为例）1．进入NCBI主页：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/在search后面选择Gene，在for后面填写需要查找的基因的名字。如图所示：点击“Go”，出现以下界面：出现了很多基因序列，在每个序列的右边还有“OrdercDNAclone”的链接，这些序列中有些序列是跟你的目的基因同名的，有些是别名（OtherAliases）与你的目的基因一致，根据每个序列的介绍认真选择你的目的基因。上图中我需要的IL6是标号为2的序列。2.1查找cDNA序列2.1.1点击OrdercDNAclone,出现目的页面如图所示：一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 7  2.1.2点击CloneSequence后面的链接即可得到cDNA序列。点击后如图所示（只抓取其中一部分）：2.2查找mRNA、蛋白序列回到步骤1点击“Go”之后出现的页面，点击目的基因的名字，出现以下页面(只抓取一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 8  相关部分)：页面的下半部分，即可以获取mRNA和蛋白序列的部分：找到“NCBIReferenceSequences(RefSeq)”，它分为几个板块，第一个“mRNAandProtein”区可以让我们找到连续的编码mRNA序列和蛋白序列。在mRNAandProtein一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 9  下面有两个序列代码（中间划有一个箭头），这代表了mRNA序列和蛋白序列。分别点击就可以得到相应的序列页面。点击后如图所示，mRNA序列：蛋白序列如下：NCBIReferenceSequences(RefSeq)的第二个板块是Referenceassembly，它下面显示的是Genomic，点击Genomic下面Referenceassembly对应的Genbank或FASTA即可出现编码的DNA序列（注意：只是编码序列，其中包括内含子，但一般没有5‘非编码区）。这一步就不做贴图演示了吧，呵呵。这样我们就可以找到基因的cDNA序列、连续的编码mRNA序列、蛋白序列以及含有内含子的编码DNA序列了。相信这些操作对很多战友还是有用的。如果大家有更好的方法，欢迎发帖交流！友情提示：在NCBI里打开的每一个页面都会给我们提供大量的信息，大家不妨好好看看，可能会有令我们惊喜的收获！最后唠叨一句：最近我实验比较忙，只能在深夜发帖，可能要过几天再发第三部分[Partthree运用STS查找已经公布的引物序列]，希望“期待下集”的朋友可以理解。一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 10  第三部分运用STS查找已经公布的引物序列STS，序列标签位点（SequenceTaggedSite）：一段短的DNA序列（200－500个碱基对），这种序列在染色体上只出现一次，其位置和碱基顺序都是已知的。在PCR反应中可以检测处STS来，STS适宜于作为人类基因组的一种地标，据此可以判定DNA的方向和特定序列的相对位置。以上内容基本是STS的定义，我主张活学活用，下面就介绍一下我个人用STS数据库查找引物的一点经验。还是使用人的IL6基因为例，呵呵1．打开NCBI主页，在Search后面的下拉菜单选择UniSTS，在FOR后面填写目的基因。操作完毕如图所示：点击GO以后出现以下页面，这是你会发现NCBI又提供了很多序列，下面我们还是要初步筛选我们需要的序列。一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 11  2．根据物种、目的阴物所在染色体的位置等选择相应序列（可能不只一个），点击。下面以点击第一个进入的画面为例。你会发现这个页面直接就给出了引物序列，PCR之后的片段长度也是给了的（247bp）。下面还有很多相关的信息……3．点击GeneBankAccession后面的代码，进入下一个页面。一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 12  啊！前后引物都呈现在眼前了，还有反应体系和反应条件！其中PrimerA是前引物序列，PrimerB则是后引物序列，并且给出了他们在DNA序列中的位置。有兴趣的朋友可以在序列中找一下，是可以找到的，不过要注意，PCR是双链扩增，在序列中可以直接找到的是PrimerA的原序列和PrimerB的互补序列。在步骤二里面我只点开了一个序列，继续打开其他的可能还会有对自己有用的引物，不过这要你自己慢慢发掘了。这种寻找引物的方法有点投机取巧的味道，实用程度不是很高，但如果这里面恰好有你想P的片段的话，恭喜你，这些引物都是很成熟的引物，可以直接拿过来使用了。如果想寻找引物，大家可以查阅相关论文，已经报道的引物我们为什么不用呢？！既省时间，可靠性又强。如果这两种方法都不能找到你需要的引物的话，那就自己设计吧，建议使用Primer5和Oligo。引物设计的详细内容我在这里就不多说了，推荐两个帖子给大家看一下，第一个是本版版主liuzeyi2002发起的，内容很丰富，很值得学习，另一个则是我发的。http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=9517792&sty=1&tpg=1&age=0http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=9523263&sty=1&tpg=1&age=0一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 13  第四部分如何运用BLAST进行序列比对、检验引物特异性提到序列比对，绝大多数战友都会想到BLAST，但BLAST的使用确实又是一个很大的难题，因为他的功能比较强悍，里面涉及到的知识比较多，而且比对结束后输出的结果参数（指标）又很多。如果把BLAST的使用详细的都讲出来，我想我发帖发到明天也发不完，更何况我自己也不是完全懂得BLAST的使用。所以我在这里也就“画龙点睛”——以比对核酸序列为例来给大家介绍一下BLAST的使用，也算是BLAST的入门课程吧。请看帖的战友好好体会，如果你用心看，在看帖完毕之后BLAST的基本使用（包括其他序列的比对）应该没有问题了。1．打开BLAST页面，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/打开后如图所示： 对上面这个页面进行一下必要的介绍：BLAST的这个页面主体部分（左面）包括了三部分：BLASTAssembledGenomes、BasicBLAST、SpecializedBLAST。相信大家可以看懂这三个短语的意思，我就不多说了；我要说的是，可以认为这是三种序列比对的方法，或者说是BLAST的三条途径。第一部分BLASTAssembledGenomes就是让你选择你要比对的物种，点击相应物种之后一步一步教你使用NCBI苏州大学生命科学学院医学遗传 14  即可进入比对页面。第二部分BasicBLAST包含了5个常用的BLAST，每一个都附有简短的介绍。第三部分SpecializedBLAST是一些特殊目的的BLAST，如IgBLAST、SNP等等，这个时候你就需要在SpecializedBLAST部分