第五章-动物源性生物制品

第五章动物来源生物制品的制备第一节动物源性生物制品概述一、动物来源药物的特点我国应用动物药物历史悠久，4000年前就已经使用40多种动物药。本草纲目中收集了440种，中国药用动物志收载了1500多种。到20世纪50年代开始，我国陆续开展了动物药物的研究与生产，其中取得的重大成果是关于胰岛素的研究，1965年得到结晶牛胰岛素。生物药物在治疗和预防疾病方面有其他药物不可取代的特点，所以越来越引起人们的注意。动物来源药物的特点：原料来源丰富，牛、猪、羊的器官、组织、腺体、血液、毛角等都可做为原料，来源丰富且健康、新鲜，品种繁多，可以制备出人体所需要的各种活性物质；要重视安全性，动物与人体种属差异大，活性物质的结构有一定的差异，蛋白质是抗原，不同来源的蛋白质注射于人体内要产生抗原反应，严重时会有生命危险。二、动物来源药物的种类与用途1、动物多肽与蛋白质类药物（1）、动物多肽药物的重要性与种类1）重要性：脑垂体所分泌的多肽激素，药效显著，且毒副作用小，细胞因子已有近百种，通过对这些活性物质的结构和功能的研究，有助于我们设计和研制新型药物。2）种类：多肽类激素：垂体多肽激素（促肾上腺皮质激素、促黑激素、脂肪水解激素、催产素、加压素）；下丘脑激素（促甲状腺激素释放激素、生长素抑制激素、促性腺激素释放激素）；甲状腺激素（甲状旁腺素、降钙素）；胰岛激素（胰高血糖素、胰解痉多肽）；胃肠道激素（胃泌素、胆囊收缩素-促胰酶素、肠泌素、肠血管活性肽、抑胃肽、缓激肽、P物质）；胸腺激素（胸腺素、胸腺肽、胸腺血清因子）。多肽类细胞因子：脑氨肽、蛇毒、胎盘提取物、脾水解物、肝水解物、心脏激素、转移因子、抗癌肽等。（2）、动物蛋白类药物蛋白质激素（生长素、催乳激素、促甲状腺素、促黄体生成激素、促卵泡激素）；血浆蛋白质，动物血浆制品不能用于人类；蛋白质类细胞因子；粘蛋白（胃膜素、硫酸糖肽、内在因子、血型物质）；胶原蛋白（明胶、阿胶、氧化聚合明胶）；其他：硫酸鱼精蛋白、胰蛋白酶抑制剂。2、动物酶与辅酶类药物种类：促消化酶类（胃酶可口服，蛋白酶，胰酶）；消炎酶类（溶菌酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等可提高毛细血管通透性，消退浮肿）；治疗心血管疾病（纤溶酶、尿激酶、凝血酶）；抗肿瘤的酶（天冬氨酰酶、谷氨酰胺酶、半胱氨酸酶、组氨酸酶）；与氧化还原电子传递有关的治疗酶（细胞色素c、超氧化物歧化酶、过氧化物酶）；其他药用酶（有机磷解毒酶、青霉素酶）。动物辅酶类药物：大多数属于核苷酸类药物。3、动物核酸类药物（1）、组成与作用核酸由核苷酸、核苷酸、核苷、碱基及其衍生物。可用在癌症、肝炎、抗放射性、心脏病等方面的治疗。（2）、主要种类和用途DNA：能改善机体虚弱疲劳、与细胞毒药物合用可提高细胞毒药物对癌细胞的选择性作用，与红霉素合用，可降低毒性、提高疗效；RNA：口服可用于精神迟缓、记忆衰退、动脉硬化性痴呆、静注用于刺激造血和促进白细胞生成、治疗慢性肝炎、肝硬化和初期癌症；辅酶A用于动脉硬化、白细胞、血小板减少，肝、肾病等；ATP用于心力衰竭、心肌炎、心肌梗死、脑动脉和冠状动脉硬化、急性脊髓灰质炎、肌肉萎缩、慢性肝炎等。4、动物糖类药物单糖、寡糖、多糖。多糖以粘多糖为主，是一类胞外生物大分子物质，是动物体内蛋白多糖分子中的糖链部分，可抗凝血、降血脂、抗病毒、抗肿瘤和抗放射性。（1）、粘多糖的种类与分布粘多糖（中性和酸性）、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等。粘多糖主要分布在动物骨、软骨、皮、角、血管、肠、滑膜液、脑、角膜、肺、肝、心、尿等原料中。甲壳质：虾、蟹、昆虫等甲壳动物外壳，高等植物细胞壁，人造皮肤、血管、手术线；消炎、降低胆固醇和血脂。肝素：肠黏膜、肺、肝、心、肾等部位，抗凝血药物，外科手术后防止形成血栓，可预防血栓形成。（2）、制备方法原料处理，提取有效成分，去除非粘多糖，脱色，脱蛋白，纯化，用乙醇分级沉淀，季铵盐络合沉淀，离子交换柱层析，分子筛分离，亲和层析等。5、动物脂类药物溶于氯仿、苯、石油醚等非极性溶剂，而不溶于或微溶于水中，可分为脂肪、类脂和衍生物，又可分为复合脂和简单脂。（1）、脂类药物的种类与分布脂肪酸及其衍生物、磷脂类、胆酸类、卟啉和衍生物。主要为脂肪酸和磷脂，分布在脑、脊髓等神经组织中，脂肪组织、赶等含量也较丰富，胆酸分布在胆汁中，卟啉以血液为主。脂类药物的一个特点是，从生物组织中制得的药物再经过分子改造可以得到更高疗效的产品。脑磷脂可止血、防动脉硬化以及神经衰弱；卵磷脂防治动脉硬化、神经衰弱和肝病。（2）、制备方法提取法：将原料粉碎后用适当的有机溶剂进行直接提取，再经纯化即得到。水解法：将目的产物与其他不需要的成分进行水解分离，提取纯化；生物转化法：利用酶、微生物发酵、动植物细胞培养来生产药物；化学合成或半合成。6、动物细胞因子动物来源的细胞生长调节因子。三、几种重要的动物源性生物制品1.动物血红素铁强化剂和抗贫血药卟啉类药物前体从动物全血或红细胞中提取2.胰蛋白酶抗炎药皮革加工从牛、羊、猪胰脏中提取3.胰酶助消化药动物胰腺中提取主要成分：胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶4.胰岛素从猪胰脏中提取治疗糖尿病5.胸腺肽从小牛、猪、羊胸腺中提取调节细胞免疫功能、抗衰老、抗病毒6.胆红素血红蛋白分解代谢后的还原产物治疗乙脑、血清肝炎、肝硬化从猪胆汁中提取7.肝素肝素首先从肝脏发现而得名，天然存在于肥大细胞，现在主要从牛肺或猪小肠黏膜提取。1、抗凝血：2、抑制血小板，增加血管壁的通透性，并可调控血管新生。3、具有调血脂的作用。4、可作用于补体系统的多个环节，以抑制系统过度激活。与此相关，肝素还具有抗炎、抗过敏的作用。8.硫酸软骨素9.溶菌酶第二节、动物来源生物制品制备的实例1、胰岛素的制备（productionofinsulin）（1）胰岛素的性质：pI=5.3-5.4，由A链、B链通过两个二硫键连接；A链含21个氨基酸，B链含30个氨基酸；是所有蛋白质中研究得最多，也是研究得最清楚的蛋白。（2）工艺路线（图3-5）猪胰脏提取乙醇，草酸，10-15℃提取液碱化氨水，pH8-8.4碱化液酸化硫酸，pH3.6-3.8,5℃酸化液浓缩30℃以下，减压浓缩液去脂速热速冷去脂溶液盐析NaCl,pH2-2.5盐析物水、丙酮、氨水（pH4.2~4.3）除酸性蛋白滤液锌沉淀氨水，Zn（Ac）2，pH6.0沉淀除碱性蛋白，结晶Zn（Ac）2，丙酮、氨水，pH8.0，5℃以下，柠檬酸调pH6.0结晶洗涤，干燥水、丙酮、乙醚胰岛素精品图3—1猪胰岛素生产的工艺路线（3）工艺要点①提取：绞碎胰脏，加2.3-2.6倍的86%-88%乙醇和5%的草酸，提取3h。②浓缩：30℃减压浓缩至比重为1.04-1.06为止。③除酸性蛋白：加入7倍量的蒸馏水溶解，再加3倍量冷丙酮，用氨水调pH至4.2-4.3，补加丙酮，离心去除酸性质白沉淀。④锌沉淀：用氨水调pH为6.2-6.4，加入3.6%醋酸锌溶液（20%浓度），再用氨水调pH至6.0，4℃放置过夜；收集沉淀。⑤除碱性蛋白、结晶：每克加冰冷的2%柠檬酸溶液50mL，6.5%醋酸锌溶液2mL，丙酮16mL，用冰水稀释至100mL，使充分溶解；冷至5℃以下，用氨水调至pH至8.0，过滤；滤液用10%柠檬酸溶液调pH6.0，补加丙酮，慢速搅拌3-5h使结晶析出；再转入5℃左右放置3-4d，使结晶完全；收集结晶，用丙酮、乙醚脱水后，真空干燥，即得结晶胰岛素。2、超氧化物歧化酶（SOD）的制备超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）与机体抗衰老、肿瘤发生、自身免疫疾病和辐射防护等有关。用于炎症、类风湿性关节炎、慢性多发性关节炎及放射治疗后的炎症等。SOD存在于动物、植物、微生物中，有Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等。牛红细胞SOD为Cu-Zn-SOD，由两个亚基组成，每个亚基含1个Cu和1个Zn。在pH7.6-9.0时稳定。它催化超氧负离子歧化为H2O2。新鲜猪血去血浆，离心红细胞0.9%NaCl,反复洗涤3次收集（1）工艺路线（图3-2）浮洗净红细胞溶血血去离子水，5℃,30min溶血物去血红蛋白乙醇，氯仿,15min上清液沉淀丙酮，0℃沉淀物去离子水55-65℃，10-15min黄绿色澄清液沉去不溶蛋白，透析丙酮，去离子水，0℃，6-8h透析液吸附、吸脱、超滤、浓缩、干燥DEAE-SephadexA50,磷酸缓冲液（K3PO4），pH7.6SOD成品图3-6猪血SOD生产工艺路线（2）工艺要点①收集：离心去黄色血浆，红细胞用0.9%NaCI溶液离心浮洗3次。②溶血、去血红蛋白：加去离子水，5℃下搅拌30min后加入乙醇和氯仿，搅拌15min；离心去血红蛋白，收集上清液。③沉淀、热处理：0℃下将上清液加入1.2-1.5倍体积的丙酮，产生絮状沉淀；离心去上清液，得沉淀物；沉淀物加适量蒸馏水溶解，上清在55-65℃下热处理10-15min，除去热变性蛋白，收集黄绿色澄清液。④沉淀、去不溶蛋白：澄清液在0℃下加入适量丙酮，使其产生大量絮状沉淀；离心去上清液；沉淀用去离子水溶解，除不溶性蛋白；上清液置透析袋中得透析液。⑤吸附、洗脱、超滤、冻干：透析液加到用磷酸缓冲液平衡好的DEAE-SephadexA50柱上吸附，用磷酸钾缓冲液梯度洗脱，收集SOD活力洗脱液，超滤浓缩后，冷冻干燥得SOD成品。⑥电泳鉴定条件：0.5%琼脂糖凝胶平板电泳法，用聚丙稀酰胺凝胶电泳方法鉴定更灵敏。3、用肝脏生产核糖核酸（RNA）用肝脏生产的动物RNA具有其他生物来源RNA所不具有的药物功能。提纯难度较大。（1）工艺路线图(图3-7肝RNA生产工艺路线)匀浆健康猪/牛肝0.1mol/LNaCl,0.05mol/L柠檬酸钠，PVS(聚乙烯硫酸脂），Triton×100(表面化性剂）清液提取三乙醇胺，SDS,EDTA,苯酚，震荡，离心清液除蛋白氯仿，震荡，离心，反复三次清液沉淀醋酸钾，－20℃乙醇，0℃，1h离心沉淀除糖原0.001mol/LEDTA,NaAc,K2HPO4,乙二醇甲醚，0℃离心清液精制制0.2mol/LNaAc,CTAB,0℃,离心0.5h沉淀洗涤0.1mol/LNaAc,EDTA,70%乙醇，反复洗5次，离心沉淀溶解0.001mol/L,EDTA,0.14mol/LNaAc,溶解，过滤除菌无菌RNA溶液制剂装灌，冻干RNA成品（2）工艺要点①匀浆：肝用生理盐水洗净，切成小块，加入1-2倍量柠檬酸钠、聚乙烯硫酸脂（PVS）TritonX100（pH7.0）溶液，用组织捣碎机捣成匀浆，离心。②提取：加入等体积三乙醇胺、十二烷基磺酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA，pH9.0）溶液，搅拌均匀后，加等体积苯酚（含0.2%8-羟基喹啉）及等体积氯仿；室温振荡30min，离心20min。③除蛋白：离心清液中加入等量氯仿振荡，反复2-3次，至中间界面无明显蛋白层为止。④乙醇沉淀：清液中加入1/10体积KAC和两倍体积－20℃乙醇；0℃放置1h，离心得白色沉淀。⑤除糖原：将沉淀溶于含EDTA-0.01mol/LNaAc溶液中，加入等体积K2HPO4,搅拌下再加入等体积乙二醇甲醚，0℃放0.5h，离心得清液。⑥络合：清液在0℃下搅拌加入等体积0.2mol/LNaAc溶液和1/4体积1%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）；0℃放0.5h；离心取沉淀。⑦洗涤：沉淀用NaAc，70%乙醇溶液反复洗涤5次，至无泡沫为止。