EASYspin-石蜡包埋组织RNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书

杭州昊鑫生物科技股份有限公司htpp://快速提取试剂盒目录号：RN3001适用范围：适用于快速从福尔马林固定、石蜡包埋组织样品中提取总RNA，RNA可用于反转录PCR，荧光定量PCR。试剂盒组成、储存、稳定性：本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。储存事项：1.所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。2.不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。3.为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后，◆TRIpureReagent抽提指南◆目录号RP02◆使用手册◆实验室使用，仅用于体外◆TRIpureReagent抽提指南◆目录号RP02◆使用手册◆实验室使用，仅用于体外◆TRIpureReagent抽提指南◆目录号RP02◆使用手册◆实验室使用，仅用于体外试剂盒组成保存50次(RN3001)裂解液PKD室温15ml结合液RBC室温25ml漂洗液RW室温10ml第一次使用前按说明加指定量乙醇蛋白酶K粉40mg/ml-20℃20mgRNase-freeH2O室温10ml基因组DNA清除柱和收集管室温50套RNA吸附柱RA和收集管室温50套杭州昊鑫生物科技股份有限公司htpp://毫升灭菌水溶解（终浓度40mg/ml）。因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量)分装冻存，－20℃保存。4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。注意事项1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf5415C或者类似离心机。2.样品处理量绝对不要超过基因组DNA清除柱和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或者产量降低。不同组织细胞种类RNA/DNA相差极大，例如胸腺脾脏DNA含量丰富，超过5mg就会超过柱子处理能力。COS细胞RNA含量丰富，超过3x106细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量，如不超过2个10μm厚度石蜡切片。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。3.裂解液PKD、结合液RBC中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。4.预防RNase污染，应注意以下几方面：1)经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。2)使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。3)RNA提取过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。4)配制溶液应使用无RNase的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。）5.关于DNA的微量残留：杭州昊鑫生物科技股份有限公司htpp://的微量残留（DNase消化也无法做到100%无残留），本公司的EASYspin固定包埋组织RNA快速提取试剂盒，由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：1)选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。2)选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。6.RNA纯度及浓度检测：完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。由于石蜡包埋组织福尔马林固定和包埋过程中一般由于RNA与蛋白反应交联会导致RNA断裂或者降解，一般电泳后UV下只能看到模糊弥散（smear）带型，随着储存的时间越长，降解断裂越严重，甚至只能看到峰值仅仅在100bp左右的模糊条带。这都属于RNA提取正常情况。纯度：OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的RNA，OD260/OD280读数（10mMTris,pH7.5）在1.8-2.1之间。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mMTris，pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260,OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）=(OD260)×(稀释倍数n)×40。操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）提示：杭州昊鑫生物科技股份有限公司htpp://第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量无水乙醇!1.修整去除过量包埋组织外石蜡，并切片成5-20μm厚切片（开始的2-3片抛弃不用）。2.收集总厚度不超过■40μm的石蜡切片到一个1.5-2ml离心管（例如2片20μm、4片10μm、8片5μm的石蜡切片），或者不超过▲80μm的石蜡切片到一个2ml离心管。■代表处理切片总厚度≤40μm，▲代表处理切片总厚度≤80μm3.加入1ml100%二甲苯，涡旋振荡10秒。瞬间离心把组织全部浸入到二甲苯。4.50℃水浴3分钟熔解石蜡，20-25℃最高速离心2分钟，收集组织到管底。5.小心用移液器吸弃上清二甲苯，注意不要吸到沉淀。6.加入1ml无水乙醇，涡旋振荡，最高速离心2分钟，小心吸弃上清乙醇。7.加入1ml无水乙醇，重复步骤6一遍，尽可能吸弃所有乙醇。8.室温或者37℃晾干乙醇10分钟或直到所有乙醇挥发干。乙醇完全晾干非常重要，微量的乙醇残留也会导致RNA产量降低。9.重悬吹打或者涡旋振荡充分重悬组织沉淀在■150μl▲240μl裂解液PKD中，短暂离心收集液体到管底，加10μl蛋白酶K，吹打混匀。10.55℃孵育15分钟，然后80℃孵育15分钟。55℃孵育后，可以将离心管取出放置在室温，等水浴锅温度升到80℃后再放入水浴锅，精确的孵育15分钟。即使2分钟的延长也可能导致RNA的部分降解。11.加入■320μl▲500μl结合液RBC，充分吹打混匀调节结合条件。12.立刻将混合物加入一个基因组DNA清除柱中，（清除柱放入收集管中）14,000rpm离心60秒，保留滤过液（RNA在滤过液中）。应避免吸到可能有的较大的未消化完全的絮团物质上柱子，以免堵塞离心柱。杭州昊鑫生物科技股份有限公司htpp://加入■720μl▲1200μl无水乙醇到滤过液中，立即吹打混匀，不要离心。14.立刻将混合物(每次小于700μl，多可以分多次加入)加入一个RNA吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心30秒，弃掉废液。15.加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW,重复一遍。16.将吸附柱RA放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。17.取出吸附柱RA，放入一个RNasefree离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30μlRNasefreewater（事先在70-90℃水浴中加热可提高产量），室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要RNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，如果需要RNA浓度高，可以将洗脱液放回吸附柱RA，再洗脱一遍。