环介导等温扩增技术快速诊断猪肺炎支原体Loopmediate

农业生物技术学报袁2010年袁第18卷袁第4期袁第822~826 JournalofAgriculturalBiotechnology,2010,Vol.18,No.4,822~826技术改进UpdatedTechnology环介导等温扩增技术快速诊断猪肺炎支原体郭盼盼黄书林张跃伟付萍李旭妮李佳禾吴文学*中国农业大学动物医学院，北京100193 *通讯作者，[e-mail] 摘要利用环介导等温扩增(loop­mediatedisothermalamplification,LAMP)方法建立了猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoinae)的快速检测方法。该方法以猪肺炎支原体保守性基因16SrRNA为靶序列设计了6条特异引物，在63℃等温条件下，30min即可完成反应。结果显示,LAMP技术优于PCR技术。在敏感性实验中，LAMP方法的能检测出10个包含靶基因片段的重组质粒，敏感性高于PCR方法10倍；特异性实验中，LAMP方法和PCR方法均显示出了高度的特异性；在对127个临床鼻拭子样本的检测中，LAMP方法检测结果是所有样本都为阳性，而PCR检测出了116份阳性。证明本研究所建立的方法，对临床样本的检测的敏感度高于常规的PCR法。LAMP方法具有操作简便、快速、高效、敏感、特异、经济的特点，在研究机构以及基层实验室、现场监测的广泛使用具有一定的潜力。关键词猪肺炎支原体(Mhp)，环介导等温扩增技术(LAMP)，PCR Loop­mediatedIsothermalAmplificationforSensitiveandRapidDetection ofMycoplasmahyopneumoniae GuoPanpanHuangShulinZhangYueweiFuPingLiXuniLiJiaheWuWenxue * VeterinaryMedicineDepartment,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China *Correspondingauthor,[e-mail] DOI:10.3969/j.issn.1674­7968.2010.04.031 DOI:10.3969/j.issn.1674­7968.2010.04.031基金项目：本项目由农业部重点项目(No.2008­G57)资助收稿日期：2009­04­03接受日期：2009­05­21Abstract Usingtheloop­mediatedisothermalamplification(LAMP),anovelmethodofgeneamplificationforMycoplasmahyopneumoniae detectionwasestablished.Asetofsixprimerswasdesignedspecificitytorecognize the16SrRNAgene,whichisarelativelyconservedregionofM.hyopneumoniae.TheLAMP­basedassaycouldbe completedwithin30minat63℃ .ResultsshowedthattheLAMP­basedassay,comparedwithPCR,hadhigh superiority.ThedetectionlimitoftheLAMPassaywasfoundtobe10copiesperreactiondeterminedbyusinga recombinedplasmidcontainingthetargetsequence,whichwas10­foldhigherthanthatofthePCRassay.In addition,bothLAMPandPCRwerehighlyspecifictoM.hyopneumoniae.Furthermore,theLAMPandPCRassay wasappliedto127clinicalnasalswabsamplescollectedfrompigfarms.FortheLAMPassay,allthenasalswab specimenstestedpositive,whileforthePCRassay,116nasalswabspecimenstestedpositive.Thedataconfirmed thatLAMPwasmoresensitivethanPCRforthedetectionofclinicalsamples.TheLAMPassayiseasytoperform, extremelyrapid,highlysensitive,specificityandcost­effective,thereforeithasthegreatpotentialitysuitablefor diagnosisofM.hyopneumoniae bothinwell­equippedlaboratoriesandinfieldsituations.KeywordsMycoplasmahyopneumoniae(Mhp),Loop­mediatedisothermalamplification(LAMP),PCR猪支原体肺炎(mycoplasmalpneumoniaof swine，MPS)，又称猪气喘病，国外又被称为猪地方性肺炎(swineenzooticpneumonia)是由猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoinae，Mhp)引起猪以咳嗽和气喘为主要症状的慢性接触性呼吸道传染病。MPS在世界各地广泛传播，以接触性、高度传染性、慢性、高发病率和低病死率为特点，病猪长期生长发育不良，生长率和饲料转化率降低，感染后引起猪免疫力降低，临床上经常与多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪繁殖与呼吸综合症病毒等混合感染，是猪呼吸道综合症(porcinechronicrespiratoryinfectious disease，PRDC)的一个最重要的病原(Thackeretal., 1999;Thackeretal.,2001;Verdinetal.,2000)，对养猪业的危害非常大(WoesteandGrosse,2007)。由于Mhp对培养基的营养要求非常苛刻，生长缓慢，初次分离时在固体培养基上生长往往需要10d左右才能观察到细小的菌落(Dubossonetal.,2004)，另外常因猪鼻支原体或滑液支原体的过度生长而被掩盖(KobischandFriis,1996；Maesetal.,1996)，因此不适合常规诊断(Okadaetal.,2005)。病原核酸扩增技术的发展为检测动物组织或鼻拭子中的支原体创造了条件。环介导等温扩增(loop­mediatedisothermalamplification,LAMP)技术是Notomi等(2000)开发的一种恒温条件下的核酸扩增技术，已经广泛应用于对细菌、病毒以及寄生虫等病原体的检测，具有操作简单、高敏感、特异性强的特点。本实验以猪肺炎支原体的保守性基因16S rRNA，成功设计并筛选出了一套引物，建立了高效、特异的检测猪肺炎支原体的LAMP方法。1结果与分析1.1LAMP与PCR的敏感性分别在LAMP和PCR反应体系中各加入10 6 ~10 0拷贝的质粒，再以建立好的LAMP和PCR反应体系和条件进行反应，如图1A所示LAMP检测方法能在35min内检测到10个拷贝，而如图1B所示PCR检测方法仅能检测到10 2拷贝。结果表明LAMP检测方法的检测极限高于PCR检测方法10倍。1.2LAMP与PCR的特异性本实验用4株猪肺炎支原体和其它12种造成呼吸系统疾病的病原来检测LAMP和PCR两种方法的特异性，如图2所示，两种方法检测猪肺炎支原体的4种菌株均有特异性扩增，而其它病原无特异性扩增。说明两种方法的特异性都很好。1.3临床样本的检测用已建立的PCR和LAMP方法都用于检测发病猪场的127个鼻拭子样本DNA。LAMP检测方法阳性检出率为100%(127/127)，而PCR检测方法的阳性检出率为91.3%(116/127)。进一步说明LAMP检测方法的敏感性高于PCR检测方法。2讨论自Notomi等(2000)首次报道LAMP技术以来，LAMP技术广泛应用于细菌、病毒和寄生虫检测，并显示出明显的优点：(1)特异性好，6条引物对靶序列的8个特异序列区的识别,保证了LAMP扩增的高度特异性。(2)敏感性高，由于特殊的引物设计，使得引物介导的链延伸循环过程和子代DNA自身环化形成茎环结构引导链延伸过程同时存在，因此反应效率很高，在1h内实现109扩增(Notomietal., 2000)，可检出几个拷贝的靶基因片段。(3)操作简便，LAMP方法在等温条件下扩增，不需要模板的热变性、长时间的温度循环过程，只需恒温水浴锅即可完成整个反应。(4)结果易于判定，在LAMP反应过程中，从dNTPs中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中图1猪肺炎支原体LAMP反应的浊度变化曲线图(A)和PCR产物(B) M：DM2000plusmaker(HT­biotech)；N：阴性对照；0~6：分别为10 0、10 1、10 2、10 3、10 4、10 5和10 6拷贝/样本Figure2SensitivityoftheLAMPfordetectionofM.hyopneumoniae monitoredbyreal­timeturbidityassay(A)and theproductofPCR analyzed(B) M：DM2000plusmaker(HT­biotech);N：Negativecontrolwith notemplateDNAinreaction;0~6：10 0 ,10 1 ,10 2 ,10 3 ,10 4 ,10 5 , and 10 6 copiesperreaction,respectively At/s 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 2520 1440 360 1080 1800 2160 720 bp 750 500 100 581 N 0 1 2 3 4 5 6 M bp B环介导等温扩增技术快速诊断猪肺炎支原体Loop­mediatedIsothermalAmplificationforSensitiveandRapidDetectionofMycoplasmahyopneumoniae823农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology M N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1213 14 1516 750 500 250 100 bp A图2LAMP特异性实验2%凝胶电泳图(A)和PCR产物1%凝胶电泳图(B) M：DM2000plusmaker(HT­biotech)；N：阴性对照；1~16：分别为猪肺炎支原体168株、济南株(Z株)、VP11株、J株、猪胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、多杀巴氏杆菌、猪霍乱沙门氏菌、支气管败血性博德特氏菌、葡萄球菌、猪链球菌、布氏杆菌、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪瘟病毒Figure2TheproductofLAMPanalyzedbyelectrophoresisin 2%agarosegel(A)andtheproductofPCRanalyzedby electrophoresisin1%agarosegel(B) M：DM2000maker(HT­biotech);N：Negativecontrolwithout templateDNA;1~16：Mycoplasmahyopneumoniae168,Z,VP11, J,Actinobacilluspleuropneumoniae,Escheric