20章基因工程

第二十章基因工程第一节自然界的基因重组一、转化作用二、转导作用三、转位（转座）一、Transformation转化作用InsertionCrossingover二、Transduction转导作用转导Transduction:由病毒介导的DNA由一个细胞向另一个细胞转移的现象。随后DNA会整合到受体细胞的基因组中。三、基因重排将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。通过基因重排调节基因活性的典型例子是免疫球蛋白结构基因和T－细胞受体基因的表达。在所有物种中，胚系Ig基因的构成基本上相同。Ig重链和轻链(λ和κ链)基因座都由多个编码V区(可变区）和C区（恒定区）蛋白质的基因组成，并被非编码的DNA（连接区，J区）所分隔。V、C、J区在胚胎期细胞中相距较远，细胞发育分化时，免疫球蛋白重链基因DNA重排，大量间隔序列被切除，使位于J-Cμ之间的增强子序列得以发挥作用，增强基因转录。四、（转位）转座能将自身插入基因组新位置的DNA序列。1转座子的定义（1）含短的末端反向重复序列;（2）含编码转座酶的基因;（3）靶位点存在5-9bp的短正向重复序列。第二节基因克隆的工具酶识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，与相伴的甲基化酶共同构成细菌防御机制——限制修饰体系（限制外源DNA，保护自身DNA）HindⅢ流感噬血杆菌种属d株第三种内切酶限制性核酸内切酶命名：属名、种名、株名限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）切割DNA后有粘端与平端之分或产生平末端识别位点常为4-6个碱基对、具有回文结构的DNA片段AATGAATTCGTACCGTTACTTAAGCATGGC限制性核酸内切酶5’---NGAATTCN---3’3’---NCTTAAGN---5’5’---NGAATTCN---3’3’---NCTTAAGN---5’粘末端(Cohensiveendorstickyend）5’突出端EcoR15’---NCAGCTGN---3’3’---NGTCGACN---5’5’---NCAGCTGN---3’3’---NGTCGACN---5’平末端Pvu2（bluntend）错位切割垂直切割限制性核酸内切酶的切割频率DNA分子中核苷酸序列是随机排列的，一个识别四个核苷酸序列的内切酶平均每隔256bp（44）出现一次该酶的识别切割位点。那么，识别6或8核苷酸序列的内切酶的切割频率是多少？基因工程其他常用的工具酶酶的种类功能DNA连接酶催化DNA中相邻的5'磷酸基和3'羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶I①合成双链cDNA的第二条键②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3'末端反转录酶以RNA为模板合成cDNA第一链多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5'羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3'羟基末端进行同质多聚物加尾切除末端磷酸基团碱性磷酸酶TaqDNA聚合酶PCR扩增第三节基因克隆的载体载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它ＤＮＡ片段(外源基因)连接在它的上面，进行扩增或表达。理想载体应具备的几个条件能在宿主细胞内携带目的基因复制扩增，具有较高拷贝数。有多个限制性内切酶单一位点，便于外源基因的插入。有易检测的遗传筛选标记，如抗生素抗性基因，用于阳性克隆的筛选。分子量小，允许插入外源基因的容量较大。载体分类（按功能分）克隆载体：用于外源DNA的克隆和扩增。表达载体：用于外源基因的表达（转录翻译生成蛋白质）一、克隆载体质粒载体噬菌体载体病毒载体（一）质粒（plasmid）载体质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一般大小约106~108D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有1~3个抗药性基因，以利于筛选。质粒DNA的复制类型：低拷贝的质粒（1～十几个）：严紧型复制控制的质粒高拷贝的质粒（几十~几百个）：松弛型复制控制的质粒重要的大肠杆菌质粒载体1、pBR322质粒载体；2、pUC质粒载体；以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。（4363bp）oripBR322的结构来源pBR322质粒载体的特点：1、具有较小的分子量；它的分子量为4363bp。克隆载体的分子量大小不要超过10kb。2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。pBR322DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，pUC质粒载体人们应用多克隆位点技术，在pBR322的基础上，组入了一个在其5’-端带有一段多克隆位点的lacZ’基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。一种典型的pUC系列的质粒载体，包括以下四个部分：1、来自pBR322质粒的复制起点（ori）；2、氨苄青霉素抗性基因（ampr）,但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不在含有原来的核酸内切限制酶的但识别位点。3、大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ）的启动子及编码α-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ’基因；4、位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。AmproripUC18(3kb)MCS(Multiplecloningsites,多克隆位点）LacpromoterlacZ’MCS(Multiplecloningsites,多克隆位点）：指人工合成的含有多种限制性内切酶单一识别切割位点的DNA序列。乳糖操纵子结构与调控模式图pUC质粒载体的优点第一，具有较小的分子量和更高的拷贝数;仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500~700个拷贝。第二，适用于组织化学检测重组体；具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用，用X-gal显色对重组子进行鉴定，而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。第三，具有多克隆位点MCS区段．方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。（二）噬菌体载体（Bacteriophage，简称phage）噬菌体的生命周期噬菌体的溶菌生命周期只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：1、吸附吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上。2、注入噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞。3、转变被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所。4、合成大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质。5、组装包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒。6、释放合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来。噬菌体的生命周期噬菌体的溶源生命周期是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期λ噬菌体载体λ噬菌体基因组长48.5kb•基因组可为线状和环状两种形式(cosends)溶菌阶段溶源阶段5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’剪切连接(包装过程)(侵染细菌细胞后)GGGCGGGCGACCTCG-3’5’-CG+GC-5’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephagecosends环状线状AWBCDEFZUVGHMLKIJb2cIcrocIIOPQSRattintxisgamredcIIINCOSCOS头部基因尾部基因功能不明区溶源化重组早期控制阻遏DNA合成溶菌生长非必须区段cI基因：溶源过程控制基因。λ噬菌体的基因组结构体外包装λ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达106~108/μgDNA，λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5kb）的75%~105%。由于λ噬菌体包装时，当DNA的长度短于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此只包装它的野生型DNA（48.5KB）的75%~105%左右的ＤＮＡ，要求λ载体DNA和外源DNA长度之和在39～53kb之间。λ噬菌体载体的主要类型1.插入式载体一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的派生载体。2.替换型载体（取代型载体）具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。插入式载体：•cI基因插入失活：如λgt10等载体，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。•LacZ基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位点，插入失活后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。λ替换型载体（取代型载体）外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必需的片段(约20kb)这些载体是用Lac5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的LacZ）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择标记，使用时用EcoRⅠ水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。如EMBL系列Lac5EcoRIEcoRIEcoRIBanHISalISalIBamHIEcoRIMCSMCSCharon4AEMBL3/4Charon40替换型载体克隆外源DNA的步骤1.应用适当的核酸内切酶消化λ载体，除去可取代的DNA片段；2.将上述所得的λDNA载体臂同外源DNA片段的连接；3.对重组体的λDNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的λ重组噬菌体（左右臂连接）（三段自身连接）（插入片段）根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选（黏性质粒）柯斯质粒载体柯斯质粒载体cosmid载体：也称粘粒、柯斯载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体的cos（cohesivesite）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。设计构建的柯斯质粒一般长4～6kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体λ一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。柯斯质粒载体的特点1.具有λ噬菌体的特性；2.具有质粒载体的特性；3.具有较高容量的克隆能力(40Kb)；柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和噬菌体λ的cos位点的一段DNA构成全长4.3kb单链DNA噬菌体载体(M13)M13噬菌体载体M13是一种含单链（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链ＤＮＡ片段，这种单链ＤＮＡ片段在遗传学研究中主要用来测定ＤＮＡ序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源