4第四章发酵工程灭菌技术

第四章发酵工程灭菌技术第一节培养基灭菌第二节发酵工程培养基的过滤除菌第三节空气过滤除菌第四节发酵罐废气的过滤除菌本章学习要点1、掌握发酵工程培养基灭菌和空气除菌的原理、方法和相关计算设计。理解培养基灭菌的残留定律和空气过滤除菌的对数穿透定律。2、了解培养基灭菌和空气除菌的方法及设备流程；提高空气过滤效率措施；理解培养基连续灭菌和分批灭菌的特点及高温短时灭菌技术原理；培养基连续灭菌和分批灭菌技术的应用。3、了解影响培养基灭菌的因素；掌握常用空气过滤介质类型和特点；理解L90的意义。染菌的危害性灭菌的方法培养基灭菌的要求液体培养基灭菌的特点知识点：热灭菌原理重点：一、概述第一节培养基灭菌微生物的培养过程：培养基配制→灭菌→接种→培养工程上的灭菌是指用物理或化学因子杀灭有生活能力的细菌营养体和芽孢或孢子的方法。消毒是消除病原微生物的措施。在工业中一般都笼统地称为杀菌或灭菌。工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。灭菌的目的：纯种发酵。1.灭菌的定义用物理或化学因素除去物品上所有生活微生物的方法。（一）灭菌的概念和必要性为什么要进行培养基灭菌？由于生物反应系统中通常含有比较丰实的营养物质，容易受到杂菌污染，由于杂菌的存在，会有以下各种不良后果：•1)生物反应的基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降。•2)由于杂菌所产生的一些代谢产物改变了发酵液的某些理化性质，使目标产物的提取困难，造成收得率降低或使产品质量下降。•3)污染的杂菌可能会分解产物，而使生产失效。•4)发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失效。2灭菌的必要性3工业上具体措施包括：1）使用的培养基和设备须经灭菌；2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理；3）设备应严密，发酵罐维持正压环境；4）培养过程中加入的物料应经过灭菌；5）使用无污染的纯粹种子。4培养基灭菌的目的杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。1.化学试剂灭菌2.电磁波、射线灭菌紫外线、阴极射线、X射线、γ射线3.加热灭菌（包括常压或蒸汽高压加热法）火焰灭菌、干热灭菌、湿热灭菌（二）灭菌的方法工业上培养基灭菌使用的方法是湿热灭菌。湿热灭菌简便、有效、经济。常用的化学试剂：氧化剂：0.%~0.25%KMnO4溶液、0.5%~1%漂白粉溶液醇醛类：75%酒精、0.25%新洁尔灭、10%甲醛溶液、环氧乙烷酚类：苯酚溶液、来苏尔1.化学药物灭菌利用化学试剂对微生物的氧化作用或损伤细胞等进行灭菌。利用高能电磁波、紫外线或放射性物质产生的高能粒子射线穿透微生物细胞进行灭菌。紫外线、阴极射线、X射线、γ射线2.电磁波、射线灭菌高温致死原理：由于它使微生物的蛋白质和核酸等重要生物高分子发生变性、破坏，例如它可使核酸发生脱氨、脱嘌呤或降解，以及破坏细胞膜上的类脂质成分等。每一种微生物都有一定的最适生长温度范围。当微生物处于最低温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质胶体和酶起了不可逆的凝固变性，使微生物在很短时间内死亡，加热灭菌即是根据微生物这一特性而进行的。3.加热灭菌连巴氏灭菌法(pasteurization)，亦称低温消毒法，冷杀菌法，是一种利用较低的温度既可杀死病菌又能保持物品中营养物质风味不变的消毒法。巴氏灭菌法的产生来源于巴斯德解决啤酒变酸问题的努力。当时，法国酿酒业面临着一个头疼的问题：啤酒在酿出后会变酸，根本无法饮用。而且这种变酸现象还时常发生。巴斯德受人邀请去研究这个问题。经过长时间的观察，他发现使啤酒变酸的罪魁祸首是乳酸杆菌。营养丰富的啤酒简直就是乳酸杆菌生长的天堂。采取简单的煮沸的方法是可以杀死乳酸杆菌的，但是，这样一来啤酒也就被煮坏了。巴斯德尝试使用不同的温度来杀死乳酸杆菌，而又不会破坏啤酒本身。最后，巴斯德的研究结果是：以50~60摄氏度的温度加热啤酒半小时，就可以杀死啤酒里的乳酸杆菌和芽孢，而不必煮沸。这一方法挽救了法国的酿酒业。这种灭菌法也就被称为“巴氏灭菌法”。主要原理在一定温度范围内，温度越低，细菌繁殖越慢；温度越高，繁殖越快。但温度太高，细菌就会死亡。不同的细菌有不同的最适生长温度和耐热、耐冷能力。巴氏消毒其实就是利用病原体不是很耐热的特点，用适当的温度和保温时间处理，将其全部杀灭。但经巴氏消毒后，仍保留了小部分无害或有益、较耐热的细菌或细菌芽孢，因此巴氏消毒牛奶要在4℃左右的温度下保存，且只能保存3~10天，最多16天。现行方法当今使用的巴氏杀菌程序种类繁多。“低温长时间”(LTLT)处理是一个间歇过程，如今只被小型乳品厂用来生产一些奶酪制品。“高温短时间”(HTST)处理是一个“流动”过程，通常在板式热交换器中进行，如今被广泛应用于饮用牛奶的生产。通过该方式获得的产品不是无菌的，即仍含有微生物，且在储存和处理的过程中需要冷藏。“快速巴氏杀菌”主要应用于生产酸奶乳制品。目前国际上通用的巴氏高温消毒法主要有两种：一种是将牛奶加热到62~65℃，保持30分钟。采用这一方法，可杀死牛奶中各种生长型致病菌，灭菌效率可达97.3%~99.9%，经消毒后残留的只是部分嗜热菌及耐热性菌以及芽孢等，但这些细菌多数是乳酸菌，乳酸菌不但对人无害反而有益健康。第二种方法将牛奶加热到75~90℃，保温15~16秒，其杀菌时间更短，工作效率更高。但杀菌的基本原则是，能将病原菌杀死即可，温度太高反而会有较多的营养损失。主要应用主要为牛奶的一种灭菌法，既可杀死对健康有害的病原菌又可使乳质尽量少发生变化。也就是根据对耐高温性极强的结核菌热致死曲线和乳质中最易受热影响的奶油分离性热破坏曲线的差异原理，在低温下长时间或高温下短时间进行加热处理的一种方法。其中，在60℃以下加热30分钟的方式，作为低温灭菌的标准，早为世界广泛采用。利用高温处理，虽对乳质多少有些影响，但可增强灭菌效果，这种方法称为高温灭菌（sterilization），也就是在95℃以上加热20分钟。巴氏灭菌法除牛奶之外，也可应用于发酵产品。通常，市场上出售的袋装牛奶就是采用巴氏灭菌法生产的。工厂采来鲜牛奶，先进行低温处理，然后用巴氏消毒法进行灭菌。用这种方法生产的袋装牛奶通常可以保存较长时间。巴氏消毒法也不是万能的，经过巴氏消毒法处理的牛奶仍然要储存在较低的温度下（一般＜4℃），否则还是有变质的可能性。因此市场上很多出售袋装牛奶的方法是很不规范的。巴氏消毒纯鲜奶较好地保存了牛奶的营养与天然风味，在所有牛奶品种中是最好的一种。其实，只要巴氏消毒奶在4℃左右的温度下保存，细菌的繁殖就非常慢，牛奶的营养和风味就可在几天内保持不变。（1）干热灭菌法利用热空气将微生物体内的蛋白质氧化进行灭菌。灭菌条件：160℃下处理60min将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热烘箱内，160～170℃维持1～2小时，即可达到彻底灭菌的目的。在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。火焰灭菌（灼烧），利用火焰直接将微生物杀死。是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。利用高温饱和蒸汽将物料的温度升高使微生物体内的蛋白质变性进行灭菌。灭菌条件：121℃下处理30min多数细菌和真菌的营养细胞在60℃左右处理5～10min后即可杀死；酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用80℃以上的温度处理才能杀死；而细菌的芽孢最耐热，一般要在120℃下处理15min才能杀死。（2）湿热灭菌法湿热灭菌要比干热灭菌更有效。a.原生质在含水量高的情况下易变性凝固b.蒸汽的穿透力强湿热灭菌效果：致死温度和致死时间致死温度：杀灭微生物的极限温度。致死时间：在致死温度下或以上灭死微生物所需时间。热阻：微生物在某一特定条件下的死亡时间。湿热灭菌分：a.分批灭菌b.连续灭菌间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。方法是：将待灭菌的培养基在80～100℃下蒸煮15～60分钟，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或37℃下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。加压常规加压灭菌法盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底驱尽空气后将锅密闭，再继续加热至121℃（压力为1kg／cm2或15磅／英寸2），时间维持15～20分钟，也可采用在较低的温度（115℃，即0.7kg／cm2或10磅／英寸2）下维持35分钟的方法。此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。连续加压灭菌法在发酵行业里也称“连消法”。此法只在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。主要操作：将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。培养基一般在135～140℃下处理5～15秒钟。连续加压灭菌法优点①因采用高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又可最大限度减少营养成分的破坏，从而提高了原料的利用率，比“实罐灭菌”（120℃，30分钟）提高产量5～10％；②由于总的灭菌时间较分批灭菌注明显减少，所以缩短了发酵罐的占用周期，从而提高了它的利用率；③由于蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率；④适宜于自动化操作；⑤降低了操作人员的劳动强度。高温对培养基成分的有害影响及其防止消除高温有害影响的措施（1）采用特殊加热灭菌法（2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；（3）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；（4）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌（在112℃即0.57kg／cm2或8磅／英寸2下灭菌15分钟）或间歇灭菌；（5）在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌灭菌设备l、高压蒸汽灭菌生产中使用高压蒸汽灭菌锅的型号很多手提式灭菌锅，容量小，多用于某种培养基灭菌。立式或卧式灭菌锅较大，多用于原种或少量栽培种培养基的灭菌，一般能装几十瓶或几百瓶。灭菌柜要和蒸汽锅炉配套，用于大量的原种和栽培种培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶(袋)。但投资太大，适合大型菌种场使用。立式灭菌锅2、常压蒸汽灭菌锅常压蒸汽灭菌锅是用铁锅、砖、水泥砌成的，造价低，适于一般生产单位和专业户使用。大小可根据需要而定，但最大的锅每次装料也最好不超过500公斤。3、烘箱烘箱主要是用于玻璃器皿的干燥和灭菌，也可用于其它物品烘干。（三）培养基灭菌的要求培养基灭菌程度：因发酵系统而不同（1）达到要求的无菌程度（即可以接受的范围）（2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：培养基中不同营养成分间的相互作用；对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。培养基灭菌需解决的问题：灭菌的温度灭菌的时间（四）发酵工业培养基灭菌的特点数量多含有很多固体物质有利于生产菌的生长方便易行价格便宜培养基灭菌应采用高温蒸汽灭菌——湿热灭菌湿热灭菌的优点蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；蒸汽有很大的潜热；操作方便，易管理。培养基湿热灭菌需解决的工程问题将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以接受的总数N（10-3），需要多高的温度、多长的时间为合理。灭菌温度和时间的确定取决于：•杂菌孢子的热死灭动力学•反应器的形式和操作方式•培养基中有效成分受热破坏的可接受范围知识点：致死温度、致死时间、热阻微生物的热死原理——对数残存定律菌温度与菌反应速度常数的关系影响培养基灭菌的因素重点：对数残存定律难点：灭菌温度与反应速度常数的关系二、加热灭菌的基本原理（一）相关概念致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间：在致死温度下杀死全部微生物所需要的时间。微生物对热的抵抗力用“热阻”表示。热阻指微生物在某一条件下的致死时间。营养细胞和细菌芽孢对热的抵抗力不同。相对热阻：在相同条件下两种微生物热阻的比值。（二）培养基灭菌动力学湿热蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强大的穿透力，在高温和水存在时，微生物细胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性变