5、15 基因工程--上下游技术

基因工程上、下游技术定义：基因工程技术是指将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达。基因工程药物制造的一般流程：（1）获得目的基因；（2）组建重组质粒；（3）构建基因工程菌；（4）培养工程菌；（5）产物分离纯化；（6）除菌过滤；（7）半成品检定；（8）包装1、上游阶段：首先获得目的基因，然后用限制性内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中并转大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大量复制目的基因。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。其中的(1)、(2)、(3)步骤属于上游阶段，在实验室完成。2、下游阶段：将实验室成果产业化、商品化，它主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度纯品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。上述(4)、(5)、(6)、(7)、(8)属于下游阶段。一：基因工程技术主要内容1.获得具有遗传信息的目的基因2.选择基因载体获得重组DNA3.将重组DNA分子导入宿主细胞4.鉴定带有目的基因的克隆5.目的基因的扩增及获得目的产物1、获得具有遗传信息的目的基因1鸟枪克隆法2人工合成目的基因酶促方法化学合成法聚合酶链反应(PCR)2选择基因载体获得重组DNA在体外将含目的基因的DNA片段和具有自我复制功能、并带有选择标记的载体分子进行酶切连接,获得重组DNA分子。可以作为载体的主要有质粒、噬菌体(phage)、黏粒(cosmid)、病毒载体等。3将重组DNA分子导入宿主细胞采用特定的方法将重组DNA分子转移至适当受体细胞(也称寄主细胞),并与之同步增殖。被导入的受体细胞分为两大类：第一类为原核细胞,目前常用的有大肠杆菌、枯草芽抱杆菌、链霉茵等。第二类为真核细胞,其中真核微生物主要有酵母、丝状真菌等,此外为动物细胞、植物细胞。另外也可以导人动物和植物体。导人的方法主要有转化、转染等方法,此外也可采用电融合、显微注射和基因枪等技术。4鉴定带有目的基因的克隆从大量的细胞繁殖群体中,筛选出克隆有重组DNA分子的寄主细胞。为了挑选出重组子,针对不同基因的表达产物,采用各自特有的测活方法确定其生物活性;也可以采用酶联免疫方法确定其抗原性;以目的基因为探针,通过DNA杂交方法可以直接确定重组子。5目的基因的扩增及获得目的产物培养克隆有目的基因的重组子,提取获得扩增的目的基因以进行深入的研究。将目的基因克隆至适当的表达载体,采用特定的方法将基因导入受体细胞,使其在新的遗传背景下获得活性表达,从而得到人类需要的特定目的物质。二：基因工程上游技术的主要内容1聚合酶链反应2DNA的序列测定3基因文库的构建1聚合酶链反应聚合酶链反应即PCR(polymerasechainreaction)技术,1983年由美国Mullis发明,是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,该技术的发明对分子生物学发展起到极大的推动作用,发明者获得了1993年度诺贝尔化学奖。1.1PCR技术的基本原理DNA是双螺旋分子,在高温条件下双链会发生分离成为单链DNA分子,DNA聚合酶以单链DNA分子为模板,在与待扩增DNA片段两端序列互补人工合成的引物及4种脱氧核苷三磷酸的存在条件下,合成新的DNA互补链,该链的起点取决于一对寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火位点。两条DNA单链均可成为合成新互补链的模板,鉴于引物是依扩增段两端序列互补原则设计的,因此每一条新生链的合成均起始于引物的退火位点,继而沿相反链延伸,因此每条新合成DNA链均具有新的引物结合位点。当再度加热高温条件下,使新旧DNA双链分开,重复下一轮的循环反应,经过多次循环后反应体系中双链DNA分子数,即一对引物结合位点间DNA片段的拷贝数理论上可达2n。PCR反应主要分为3个部分进行(1)模板变性(2)退火(3)延伸上述3个步骤构成一个循环,每一循环的产物将成为下一循环扩增的模板解释：双链DNA在90～95℃变性；再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上；然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。下面是一个参考程序循环：预变性94℃4分钟，循环1次(1)变性94℃1分钟(2)退火54℃1分钟延伸72℃1分钟循环30次(3)终延伸72℃7分钟循环1次1.2耐热DNA聚合酶TaqDNA聚合酶：1988年Saiki等人将TaqDNA聚合酶成功应用于PCR扩增技术。TthDNA聚合酶是由嗜热水生菌TliDNA聚合酶PfuDNA聚合酶TaqDNApoly-meraseTaqDNA聚合酶(TaqDNApoly-merase)是从嗜热水生菌(Thermusaquaticus)中分离获得的,该酶基因全长2496个碱基对,编码832个氨基酸,酶蛋白相对分子量为9.4×104,在70~75℃活性最高,即或在95℃高温仍具有活性,因此无需在每一循环反应中再加酶。在正常反应条件下,经过25~30个扩增循环(即扩增倍数达到106)后,TaqDNA聚合酶量便成为了反应进行的制约因素,如需继续扩增,要将产物DNA样品稀释1000~10000倍,作为模板再进行新的PCR扩增反应。和其他聚合酶一样,TaqDNA聚合酶也是Mg2+依赖酶,对Mg2+浓度十分敏感。PfuDNA聚合酶PfuDNA聚合酶是从嗜热菌Pyrococcusfuriosis中分离得到的,称高保真耐高温DNA聚合酶,能够纠正PCR扩增中发生的核昔酸错误。该酶比TaqDNA聚合酶及其变体错误率低10倍,PfuDNA聚合酶的超常纠错功能是由该酶性质决定的,其他耐热DNA聚合酶与PfuDNA聚合酶合用可以部分降低错误率,但达不到单独使用该酶的效果。然而PfuDNA聚合酶扩增率低于TaqDNA聚合酶,这是由于该酶具有3'→5'外切酶活性。1.3引物设计引物(primer)是指与待扩增靶DNA区两端序列互补的人工合成寡核苷酸片段,包括引物1和引物2,引物1称为Watson引物,是5'端与正义链互补的寡核苷酸,用于扩增编码链或mRNA链;引物2称为Crick引物,是3'端与反义链互补的寡核苷酸,用于扩增DNA模板链或反密码链。PCR扩增成功的关键因素之一是引物的设计,它将直接影响扩增产物的大小、位置及扩增区的Tm值。引物设计的目的是要在扩增特异性和扩增效率间取得平衡。1.引物的长度一般以15~30bp为宜,两个引物与模板DNA结合点间的距离决定了待扩段的长度。2.GC含量和Tm,一般认为G+C含量在45%~55%较好。3.引物末端的核苷酸4.引物与非扩增区的同源性5.简并引物6.嵌套式引物1.4PCR技术的新进展1.反向PCR(inversePCR,IPCR)2.反转录PCR(RT-PCR)3.定量PCR4.DNA单链构象多态性PCR5.不对称PCR(asymmetricPCR)6.多重PCR7.免疫PCR1反向PCR(inversePCR,IPCR)采用靶DNA片段无酶切位点的一种限制性内切酶,在靶DNA片段两外侧一定位置进行酶切,获得小于2~3kb的DNA片段,进行自身环化连接,依特定靶DNA片段两端外侧序列互补的原则设计一对引物,经PCR扩增后,通过引物与5'端互补结合,使得靶DNA片段两侧未知序列被扩增,扩增片段大小取决于酶切位点和靶DNA片段间的距离。2反转录PCR(RT-PCR)用于直接扩增经反转录为CDNA的特定RNA序列的PCR方法称为RT-PC方法。此方法敏感度极高,且简单易行。目前许多公司设计了多种形式的RT-PCR试剂盒,使用十分方便,例如一步法RT-PCR试剂盒,利用SuperScript逆转录酶和TaqDNA聚合酶的混合体系,所有反应在一个试管内完成,灵敏度极高,只需0.1pg总RNA便可扩增3.5kb的CDNA片段;高温反转录-PCR系统采用热稳定型RNAaseH-反转录酶,可在70℃条件下完成反转录过程,最长可反转录12kb的CDNA分子。3定量PCR定量PCR主要分为DNA-PCR和mRNA-PCR定量两类。DNA-PCR采用同位素或荧光等标记经电泳分离的PCR扩增产物,进行自显影后根据底片的曝光强弱对模板DNA进行定量。本实验需预先采用已知浓度的标准DNA模板,在PCR扩增后测定放射性并绘制标准曲线,根据标准曲线确定扩增产物量。mRNA-PCR需先经逆转录获得CDNA后再进行PCR扩增,采取同DNA-PCR定量的方法确定RNA数量,这种方法由于误差原因只能作为相对定量。4DNA单链构象多态性PCRDNA单链构象多态性是一种简单易行鉴定扩增DNA序列变化的技术,1989年Orita等发现单链DNA在进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时,迁移率与一级序列密切相关,这表明序列的微小变化会极大影响其构象。这是一种单链DNA凝胶电泳技术,根据形成不同构象等长DNA单链在非变性聚丙酷胶凝胶电泳时迁移率的变化来检测基因的变异。5不对称PCR(asymmetricPCR)不对称PCR是一种专用于制备单链DNA的不对称PCR技术,这种方法使用两种浓度差100倍的引物,低浓度的称为限制引物,在限制引物用尽前,PCR扩增产物为双链DNA,其数量呈指数上升,经约25个循环限制引物用尽只存在高浓度引物的条件下,PCR扩增产物为双链DNA的一条链,数量呈线性增加,不对称PCR技术可用于DNA序列测定。6多重PCR在同一试管内加入多对引物,扩增同一模板的若干部位,如基因某段缺失则电泳条带会有相应消失,多重PCR最多可同时扩增12条区带。这种技术已用于地中海贫血等疾病的基因诊断中。7免疫PCR免疫PCR是一种检测PCR产物的ELISA方法,用于抗原检测。采用PCR扩增的DNA分子代替ELISA中的酶以放大检出信号,连接分子将DNA和抗体连接,因此可用扩增的DNA量来反映抗原的量,从而显著提高检测抗原的灵敏度。2DNA的序列测定现在测定DNA序列主要有两类方法：1.Sanger等提出的酶法。2.Maxam及Gilbert提出的化学降解法。两种方法尽管大相径庭,但结果却是一致的。20世纪70年代两种方法刚问世时,化学方法测序重现率高,较易操作,只需高质量的化学试剂,因此为多数研究人员所接受。而酶法需单链DNA模板和特异的寡核苷酸引物及高质量的聚合酶,操作较复杂。随着M13噬菌体和载体的发展,引物合成日渐方便及测序技术的日臻完善,目前主要采用Sanger等发明的酶法测序。Sanger,Maxam和Gilber共同获得了1979年的诺贝尔化学奖。2.1Sanger双脱氧链终止法Sanger双脱氧链终止法由英国剑桥大学Sanger等于1977年发明。其基本原理是DNA聚合酶具有两种酶催化反应的特点:①能够利用单链DNA作模板合成出DNA互补链;②能够利用2‘,3’-双脱氧核苷三磷酸作为底物,使之掺入到寡核苷酸链的3'-未端,从而导致DNA链的终止。现在采用的链终止法是在加减法基础上发展起来的,加减法的创新点在于:①在DNA聚合酶的作用下进行引物延伸反应;②碱基特异的链终止;③采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离仅差一个核苷酸的单链DNA。由于此方法操作复杂使多数研究人员难以接受。Sanger等将双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)作为链终止物引入上述方法后,此方法才获得技术的突破进展,使其获得广泛使用。2.2Maxam-Gilbert化学修饰法此方法1977年由美国哈佛大学的Maxam和Gilbert发明,是基于体外研究Lac操纵子中阻抑物与操纵基因相互作用而发展起来的,最大优点是可以探测DNA构象和蛋白质的相互作用。其基本原理是用特定化学试剂处理末端标记的DNA片段,形成对碱基的特异性切割,从而产生一组具有不同长度DNA链的反应混合物,进行凝胶电泳后可根据X光片显示的相应条带,读出待测DN