01.液态活检技术及其临床应用

讲者介绍•应建明，博士，中国医学科学院肿瘤医院病理科副主任，硕士研究生导师。1998年和2000年分别获得北京医科大学医学学士和硕士学位，2007年获得香港中文大学医学博士学位。2000年起在中国医学科学院肿瘤医院病理科从事肿瘤病理诊断，并负责肿瘤分子病理检测。2012年获北京市优秀中青年医师，现为中华医学会病理学分会及中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会青委会副主任委员，中国抗癌协会淋巴瘤专业委员会青年委员。《中华病理学杂志》编委。已发表专业论文60余篇。液态活检技术及其临床应用应建明中国医学科学院肿瘤医院[e-mail]传统的肿瘤诊断技术传统肿瘤诊断技术病理检验诊断影像学检测病理组织检查（HE，IHC）血清标志物检测（CEA,PSA)核磁共振成像（MRI）正电子成像术（PET-CT）X射线断层扫描术（XRAY,CT）超声波检测（B超）内窥镜（Endoscope）分子病理检测（FISH,RT-PCR,NGS）传统的肿瘤诊断存在的问题早期筛查：标记物不统一,方法不够灵敏或是特异性不足。临床诊断:•影像学：较灵敏，特异性不足，对病灶大小有要求。•病理学：金标准，但是需要组织样本，取样会带来创伤和扩散风险，很多晚期患者无法取样或取样不足。治疗/复发转移监测：•影像学：结果普遍存在滞后性。•血清标志物：较灵敏，但是特异性不足；有些类型癌症没有合适的血清标志物。2015年十大突破技术--液态活检技术MITTechnologyReview杂志发布了2015年度十大突破技术(10BreakthroughTechnologies2015)的榜单。液态活检技术光荣上榜。液态活检：快速、简便、无痛苦、无创伤的癌症血液检测方法传统而又崭新的检测技术--“液态活检”•“液态活检”的定义：Aliquidbiopsyisaliquidbiomarkerthatcanbeeasilyisolatedfrommanybodyfluidsblood,saliva,urine,ascites,pleuraleffusion,etc.)and,aswellasatissuebiopsy,arepresentativeofthetissuefromwhichitisspread.--ChristianRolfo,BiochimicaetBiophysicaActa,2013.“液态活检”的标记物CTCsctDNA(cfDNA)主要指来自于抗凝的外周血全血，完整的肿瘤细胞主要指来自于抗凝血外周血的血浆，片段化的DNA片段一般认为来源于肿瘤原发灶/转移灶肿瘤瘤细胞凋亡/坏死释放的DNA片段活细胞，一般不宜长期保存提取纯化后的核酸，可以保存可以用于细胞学形态、结构分析；也可以分析细胞DNA、RNA、蛋白质等各类标志物一般用于DNA突变监测、甲基化等DNA修饰相关分析用于病情评价、预后判断，肿瘤早期诊断潜力不明确用于个体化治疗，肿瘤早期诊断潜力相对明确还有miRNAs，Peptides，Exosomes（外泌体），Secretomes（分泌物质组）等。ctDNA（circulatingtumorDNA），即循环肿瘤DNA，从字面意思来讲，指的是由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的DNA。但是在了解ctDNA之前，我们要知道另一个与之相关的概念——cfDNA。cfDNA（cell-freeDNA），或者叫血浆游离DNA，是血浆中游离存在的DNA，它们有的来自于正常细胞，有的来自于异常细胞（如肿瘤细胞），还有部分来自于我们外部（如病毒DNA）。来源：1、来自于坏死的肿瘤细胞2、来自于凋亡的肿瘤细胞3、来自于肿瘤细胞分泌的外排物什么是ctDNA?早在1947年，Mandel和Metais就发现血浆中存在游离的核酸分子。1977年，Leon等人发现，肿瘤患者的血浆游离DNA水平要明显高于健康人群又过了17年，人们才发现这种携带了突变信息的循环DNA是肿瘤的标志人们逐渐明白，cfDNA中携带肿瘤特有突变的那一小部分DNA，确确实实是由肿瘤细胞释放出来的，ctDNA的研究终于与肿瘤关联起来。ctDNA的发现在几乎所有种类的癌症中，都检测到了ctDNA所带有的标志性突变，并且肿瘤越晚期，病情越严重，肿瘤的恶性程度越高，ctDNA特有突变的频率就越高。一项针对15种癌症进行的ctDNA测序研究显示，分别有47%，55%，69%，82%的I-IV期癌症病人中能检测到高于一定频率的ctDNA突变；而另一项使用更高灵敏度测序技术的研究则表示，对于II期以上的病人，均能100%检测到突变。不同分期癌症的ctDNA检出情况不同癌症种类的ctDNA检出情况CtDNA临床应用领域CtDNA作为一种新的肿瘤标志物，将在肿瘤的诊断、治疗及预后检测等方面发挥重要的作用，尤其是对于一些不具有典型临床症状、检查无特异性和诊断困难的肿瘤可避免复杂的、具有创伤性的活检。ctDNA来自肿瘤细胞的体细胞突变，不同于遗传突变的是，遗传突变存在于体内每个细胞。因此，ctDNA是一种特征性的肿瘤生物标记物，并且还可以被定性、定量和追踪。检测9名接受特罗凯一线治疗的NSCLC患者血浆中ctDNA的EGFR突变情况，一直到患者进展至PD。•在接受治疗后，所有患者血浆中的含有EGFR突变的ctDNA浓度出现下降，其中8人的EGFR突变完全消失。•有6名患者的血浆中重新检测到EGFR突变的时间要比进展至PD的时间早4个月以上！随着治疗，所有9名患者的血浆中均检出一定量T790M突变。•血浆中没有检测到EGFR的3名患者，进展至PD期时，其肿瘤仅在胸腔内有缓慢进展。利用NSCLC癌患者血浆中的ctDNA检测EGFR突变现有技术用石蜡组织切片样本只能检测60copies以上的突变含量，但是用液态活检通过数字PCR平台却可以检测0-60copies之间的突变含量，更早的发现病情及耐药性，对于癌症患者如果能提前4个月发现病情的变化，生存率会大大提高。--ClinCancerRes,2014,march著名的JohnsHopkins大学最近的一项研究揭示了ctDNA的真面目，它其实是一种具备广泛应用前景、高敏感性、高特异性的肿瘤标志物，--NatureMedicine,2014,May研究者还在不同级别的肺癌患者中对CAPP-Seq进行了验证，发现II-IV期的NSCLC中检测敏感性100%，I期的NSCLC中敏感性为50%，而且在各期的肺癌中的特异性均在96%。在II-IV期和所有分期的肺癌中，根据ROC曲线计算出的AUC分别为0.99和0.95，所以CAPP-Seq具有强大的检测能力。临床资料表明，ctDNA比例低至0.019%的时候也还能够被CAPP-Seq检测到。研究者用CAPP-Seq测定的ctDNA的水平和肿瘤体积（肿瘤体积用CT和PET评估测定）之间存在显著相关性（p=0.0002，R2=0.89），除了几例I期肺癌患者的肿瘤体积明显高于其ctDNA相对应的大小。随访研究发现ctDNA水平随着疾病进展和相应的治疗，也在不断变化。对10例样本（7例阳性和3例阴性）进行了肿瘤标本（侵入性的活检）和血液标本（非侵入性的CAPP-Seq检测）在筛查和基因型（EGFR和KRAS）检测中的对比，结果发现CAPP-Seq并不比金标准肿瘤活检的检测效能差，能够准确测定肺癌的基因型。ctDNA中PI3KCA的检测可用于预测原发性乳腺癌患者的预后1.ctDNA有PI3KCA检出的乳腺癌患者，其预后要比没有检出的患者差。--BreastCancerResTreat，2015，March2.ctDNA中PI3KCA拷贝数高的乳腺癌患者，其预后要比拷贝数低的患者差。循环肿瘤细胞指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。CTC形成、播散及转移的模式图原发肿瘤血管生成侵润侵入血管内侵入血管外(CTC)血管内增殖(CTM)转移转移播散肿瘤细胞（DTC）微转移休眠灶循环肿瘤细胞（CTC）循环肿瘤微栓（CTM）凋亡的CTC侵润肿瘤细胞扩增血管生成上皮－间质转化（EMT）间质－上皮转化（MET）转移到骨髓和其他器官18CTC的稀有性和异质性Cancers,2013；NatureReviewofClinicalOncology,2010CTC的临床应用方向CTC检测6、指导用药3、术后监控1、预后评估2、疗效监测5、早期筛查4、辅助诊断用两种不同的方法检测CTC以评估非小细胞肺癌患者的预后1.ISET法检出率为104/210(50%)，CellSearch法检出率为82/210(39%)，两种方法检出CTC的患者的DFS均明显劣于无CTC检出的患者。2.ISET法检出23/210（11%）的患者外周血中含有间质化的CTC细胞，这种细胞通常意味着更强的侵袭性。ISET法和CellSearch法可以作为CTC检测的互补的方法，两种方法单独或者联合使用都可以用于检测CTC，以评估肺癌手术的预后。--Int.J.Cancer，2011，Vol129放疗前，65%患者检出CTC，平均检出率9.1CTCs/ml，明显高于放疗后的CTC平均数（0.6个）。有1名在放疗后CTC明显未降低的患者，出现远端转移。--CancerJ，2015，121(1)通过检测非小细胞肺癌患者的外周血中循环肿瘤细胞评价放疗疗效CTC可作为慢性阻塞性肺炎（COPD）患者肺癌早期诊断的新的标志物22HofmanP.，PLoSOne，2014，Vol9（10）分类COPD患者吸烟者健康人检测结果CTC+CTC-CTC-CTC-人数51634235当时是否检测出癌症NoNoNoNo5年内检测出癌症Yes(5/5)NoNoNoCTCv.s.ctDNA—互相排斥还是互为补充？1.可能来源于非肿瘤组织，特异性低；2.血浆中含量较丰富，检测方法简便；3.来自多个细胞的更全面的遗传信息，但一般来自于凋亡的肿瘤细胞；4.ctDNA用于实时监测乳腺癌等疾病的进展和疗效时，灵敏度更高；5.因为不含特异性突变，ctDNA不适用于某些癌症的检测，比如肾癌。V.S.1.细胞形态结合分子标记，特异性高；2.血液中数量稀少，检测难度大；3.只能代表肿瘤细胞的部分亚群，但是是最有侵袭性的一部分细胞；4.反向选择的CTCs检测适用于大多数癌症种类，但有些癌症检出率太低。5.完整的有活性的肿瘤细胞个体，能检测对药物的反应；可以提供新的肿瘤治疗靶点，可以帮助理解肿瘤转移的机制。CTCsCtDNACTCs与ctDNA检测的有机结合才是未来的方向！ctDNA及CTC检测与NSCLC的靶向治疗疗效的相关性1.检测EGFR突变时，ctDNA比CTCs更为灵敏，而且与原位肿瘤的一致性更高。--ClinCancerRes，2012，April2.CTC数量的减少更适宜用于作为快速评价疗效反应的标记物。文章主要通过数字PCR比较CtDNA、肿瘤标记物及循环肿瘤细胞三个方法的比较，其中CtDNA灵敏度为97%，循环肿瘤细胞87%，肿瘤标记物灵敏度为78%，。--NEJM，2013，March与肿瘤标志物检测相比，CTC及ctDNA检测更能反映病情的进展。通过ctDNA及CTC检测监测转移性乳腺癌病情进展某些病例里，ctDNA检测与病情更一致；某些病例里，CTC检测与病情进展更一致；•“液态活检”的检测技术越来越丰富，“液态活检”研究将会给临床诊断带来革命性的突破；•“液态活检”是现有病理检测技术的必要和有效的补充；•“液态活检”的准确性有待更多的临床数据进一步确认；•病理科室理应成为“液态活检”的领军科室。总结与展望27