大黄中蒽醌类成分的提取、分离和鉴定(实验报告)

大黄中蒽醌类成分的提取、分离和鉴定一、实验目的（1）熟悉蒽醌类成分的提取分离方法（2）掌握pH梯度提取法的原理和操作技术（3）学习蒽醌类化合物鉴定方法二、实验器材材料及试剂：大黄粗粉、浓硫酸、NaHCO3、Na2CO3、NaOH、浓盐酸、乙酸乙酯、石油醚、乙醚、普通滤纸、薄层层析硅胶板（2.5cm×10cm）、广泛PH试纸、剪刀、铅笔、尺子、点样毛细管、样品管等。仪器：500mL圆底烧瓶、球形冷凝管（30cm）、橡皮管、烧杯、滴管、层析缸（广口瓶）、250mL分液漏斗、布氏漏斗、抽滤瓶、水浴锅、集热式磁力搅拌器、磁子、循环水式多用真空泵、铁架台等。三、实验原理大黄为蓼科植物,味苦,性寒,具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经等功效。其主要成分为为蒽醌化合物，含量约为3%~5%，大部分与葡萄糖结合苷，游离苷元有大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等。其中，大黄酸具有羧基，酸性最强；大黄素具有β-酚羟基，酸性第二；芦荟大黄素连有羟甲基，酸性第三；大黄素甲醚和和大黄酚的酸性最弱。根据以上化合物的酸度差异，可用碱性强弱不同的溶液进行梯度萃取分离。OOOHOHR1R2大黄酸R1=HR2=COOH大黄素R1=CH3R2=OH芦荟大黄素R1=CH2OHR2=H大黄素甲醚R1=CH3R2=OCH3大黄酚R1=CH3R2=H四、实验内容大黄素的提取、分离流程图大黄粗粉10g20%H2SO4150ml加热1h,抽滤、干燥滤饼150ml乙醚回流提取1h乙醚层5%NaHCO3萃取水层（紫红色）乙醚层HCl5%Na2CO3大黄酸沉淀（粗品）水层（红色）乙醚层HCl0.25%NaOH大黄素沉淀（粗品）水层（红色）芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚沉淀（混合物）具体操作步骤1.游离蒽醌的提取（1）酸水解：称取大黄粗粉10g，加20%H2SO4水溶液150mL，在水浴上加热1小时，放冷，抽滤，滤饼用NaOH溶液洗至近中性（pH约为6），于70℃干燥后，研碎，置250mL圆底烧瓶中，加入乙醚150mL回流提取1小时（调45℃，回流即可），得到乙醚提取液。（2）蒽醌类成分的提取：乙醚提取液经薄层层析检查有大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚和大黄酚。薄层板为硅胶—CMC粘合板，展开剂为石油醚（60～90℃）：乙酸乙酯（7：3）近水平或直立展开，在可见光下，可看到四个斑点。其中最上面黄色斑点为大黄酚和大黄素甲醚的混合物,在此条件下,不能分开,其余3个斑点依Rf值（由大到小）的顺序是大黄素（橙色斑点）、芦荟大黄素（黄色斑点）、大黄酸（黄色斑点），记录图谱并计算Rf值。2.PH梯度萃取分离（1）将乙醚提取液加入250mL分液漏斗中（使用前先检漏），以35mL5%NaHCO3水溶液萃取三次，乙醚层经薄层层析检查（展开剂同上），指示已提尽大黄酸后，合并三次NaHCO3萃取液，用浓盐酸酸化至PH2-3左右，析出大黄酸沉淀。（注意：加酸时应缓慢加入，以防酸液溢出，如出现分层现象，需将上层乙醚蒸去才能析出固体）。抽滤后，刮下颗粒并称重。（2）经5%NaHCO3水溶液萃取后的乙醚层，继以35mL5%Na2CO3水溶液萃取三次，乙醚层经薄层检查（展开剂同上），指示已提尽大黄素后，合并三次Na2CO3萃取液，用浓盐酸酸化至PH2-3左右，析出大黄素沉淀。（酸化时注意操作同前）。抽滤后，刮下颗粒并称重。（3）经5%Na2CO3水溶液萃取过后乙醚层以35mL0.25%NaOH水溶液萃取四次，乙醚层经薄层检查（展开剂同上），指示已提尽后，合并三次NaOH萃取液，用浓盐酸酸化至PH2-3左右，析出芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚沉淀混合物。（酸化时注意操作同前）。抽滤后，刮下颗粒并称重。3.样品鉴定(1)碱液试验分别取各蒽醌结晶数毫克置于样品管中，加2%氢氧化钠溶液1ml，观察颜色变化。凡有互为邻位或对位羟基的蒽醌呈蓝紫至蓝色，其它羟基蒽醌呈红色。五、注意事项：（1）游离蒽醌的提取要控制温度，回流不宜太剧烈。（2）pH梯度萃取分离时，以保证提取充分，可以用薄层色谱作监测。（3）注意碱液浓度及萃取时的静置时间对实验结果的影响。六、数据记录、结果讨论与分析：1、大黄酸沉淀2、大黄素沉淀3、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚沉淀混合物0.9mg3.2mg2.9mg分别取各上述沉淀（蒽醌结晶）数毫克置于样品管中，加2%氢氧化钠溶液1ml后，观察到各样品管中溶液均呈红色、但第1根管中颜色略淡。七、思考题1、简述大黄中5种游离羟基蒽醌化合物的酸性与结构的关系。答：OOOHOHR1R2A大黄酸R1=HR2=COOHB大黄素R1=CH3R2=OHC芦荟大黄素R1=CH2OHR2=HD大黄素甲醚R1=CH3R2=OCH3E大黄酚R1=CH3R2=H酸性：ABCE≈DRf大黄素=3.60/5=0.72Rf芦荟大黄素=2.05/5=0.41Rf大黄酸=1.45/5=0.295cmm1.45cmm2.05cm3.60cm2.pH梯度萃取法的原理是什么？如何利用该方法分离大黄中的5种游离羟基蒽醌化合物？答：pH梯度萃取法的原理是由于溶剂系统pH变化而改变了它们的存在状态（游离型或解离型），从而改变了他们在溶剂系统中的分配系数。由于各羟基蒽醌结构上的不同所表现的酸性不同，用pH梯度萃取法分离他们；大黄酚和大黄素甲醚酸性相近，利用其极性的差异，用柱色谱分离之。3.结合本实验，思考设计实验方案所需因素？答：游离蒽醌的提取要控制温度，回流不宜太剧烈。要注意碱液浓度及萃取时的静置时间对实验结果的影响。八、参考文献（1）吴立军主编，《天然药物化学实验指导》北京；人民卫生出版社，2011（2）康廷国主编，《中成药薄层色谱鉴别》.北京：人民出版社，1995（3）徐选明，刘新大黄中大黄素提取工艺的优化中国中医药信息杂志2004，11，5（4）李乃明，丁宙大黄素的分离和结构鉴定广州医学院学报1985，13，3（5）朱庆玲，李瑞和大黄中大黄素的提取工艺研究时珍国医国药2006，17，3