大黄中蒽醌类成分的提取、分离和鉴定

实验一大黄中蒽醌类成分的提取、分离和鉴定实验目的：1、熟悉蒽醌类成分的提取分离方法。2、掌握PH梯度提取法的原理和操作技术。3、学习用硅胶柱色谱法分离大黄酚和大黄素甲醚。4、学习羟基蒽醌类化合物的鉴定方法。•实验原理：•本实验根据大黄中的蒽醌苷类在酸性条件下加热，可水解成游离羟基蒽醌和糖，而游离羟基蒽醌不溶于水，可溶于乙醚、氯仿等亲脂性有机溶剂的性质，从水解物中将游离羟基蒽醌提出。再利用游离羟基蒽醌的酸性不同，采用PH梯度萃取法将其分离。OOOHOHR1R2大黄酸R1=HR2=COOH大黄素R1=CH3R2=OH芦荟大黄素R1=CH2OHR2=H大黄素甲醚R1=CH3R2=OCH3大黄酚R1=CH3R2=H•实验器材：•试药：大黄粗粉、牛黄上清丸、含水氯仿（水饱和）、甲醇、乙醚、20%硫酸溶液、冰醋酸、5%碳酸氢钠溶液、5%碳酸钠溶液、0.25%氢氧化钠溶液、5%氢氧化钠溶液、盐酸、丙酮、乙酸乙酯、醋酸镁、柱层析用硅胶（100～200目）、硅胶-CMC硬板、石油醚（沸程60-90℃）-乙酸乙酯（15∶1）、石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸（15∶5∶1）等•仪器：回流装置一套、蒸发皿、层析槽、试管、梨形分液漏斗、水浴锅、电炉、薄层板、点样毛细管等•实验内容与方法：•一、游离蒽醌的提取•称取大黄粗粉50g，加20%硫酸溶液50ml，充分搅拌混匀，加氯仿200ml，热水浴上回流提取1小时，过滤得氯仿滤液。药渣继用氯仿200ml回流1小时，过滤，合并两次氯仿提取液于圆底烧瓶中，加沸石数粒，水浴上蒸馏回收氯仿至200毫升（可减压抽干氯仿）。•二、PH梯度萃取分离•1.大黄酸的分离和精制：将含有总蒽醌的氯仿液放入分液漏斗中，加5%碳酸氢钠溶液萃取数次（每次20～30m1），至萃取碱水液呈淡红色为止。合并萃取碱液，加盐酸至呈酸性（PH2～3），析出黄色沉淀。过滤，并用少量水洗沉淀物至洗出液呈中性。干燥后加冰醋酸10ml加热溶解，趁热过滤，滤液放置析晶，过滤，用少量冰醋酸淋洗结晶，得黄色针状结晶为大黄酸。•2.大黄素的分离和精制：用碳酸氢钠液萃取后的氯仿液加5%碳酸钠溶液萃取数次（每次20～30m1），（方法同上述碳酸氢钠溶液的处理）。萃取液经酸化后析出棕黄色沉淀，过滤，水洗沉淀物至洗出液呈中性，沉淀经干燥后，用15ml丙酮热溶，趁热过滤，滤液静置，析出橙色针状结晶，过滤后，用少量丙酮淋洗结晶，得大黄素。•3.芦荟大黄素的分离和精制：用碳酸钠液萃取后的氯仿液加0.25%氢氧化钠溶液萃取数次（每次20～30m1），（方法同上述碳酸氢钠溶液的处理）。萃取液经酸化后析出黄色沉淀，过滤，水洗至中性，干燥，用10ml乙酸乙酯精制，得黄色针晶的芦荟大黄素。•4.大黄酚和大黄素甲醚的分离和精制：萃取除去芦荟大黄素后余下的氯仿层，再用5%氢氧化钠溶液200ml分两次萃取，至碱水液呈无色为止，合并碱水层，加盐酸至呈酸性（PH2～3），析出黄色沉淀，过滤，水洗至中性，干燥，为大黄酚和大黄素甲醚的混合物。将此混合物溶于乙酸乙酯，用硅胶柱色谱分离。•5.柱层析法分离大黄酚和大黄素甲醚•（1）装柱取一玻璃层析柱，垂直固定在铁架台上，在管的下端垫入少量棉花，装入100～200目硅胶（约1/3高，湿法装柱）。•（2）上样将样品置于小蒸发皿中，用少量石油醚分散，另加用3倍量硅胶拌和均匀，并于水浴上缓缓蒸去溶剂。然后将含有样品的硅胶装入色谱柱的上端，并盖一圆形滤纸。•（3）洗脱将色谱柱活塞打开，洗脱剂为石油醚（沸程60-90℃）-乙酸乙酯（15∶1）混合液。•（4）收集洗脱液25ml一份，分别收集，回收溶剂至小体积，放置，即可析出结晶，合并相同晶形部分。先洗脱下的化合物为大黄酚，后洗脱下的化合物为大黄素甲醚。•三、鉴定•1、蒽醌类成分化学鉴定•（1）碱液试验分别取各蒽醌结晶数毫克置于小试管中，加2%氢氧化钠溶液1ml，观察颜色变化。凡有互为邻位或对位羟基的蒽醌呈蓝紫至蓝色，其它羟基蒽醌呈红色。•（2）醋酸镁试验分别取蒽醌结晶数毫克，置于小试管中，各加乙醇1ml使溶解，滴加0.5%醋酸镁乙醇溶液，观察颜色变化。•2、薄层层析检识•对照品的处理：取牛黄上清丸制剂（含大黄）3克,切碎,加甲醇50m1冷浸24小时,过滤,取滤液5m1蒸干,残渣加水10m1使溶解,加盐酸1m1,置水浴上加热30分钟,冷却,用乙醚20m1分两次萃取,合并乙醚液,蒸干,残渣加乙酸乙酯使溶解成1m1,为供试品溶液。•吸附剂：硅胶G-CMC-Na板•展开剂：石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸（15∶5∶1）上层溶液•点样：提取的大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的醇溶液及处理后的牛黄上清丸的醇溶液•显色剂：自然光下观察，记录黄色斑点出现的位置，然后再用浓氨气熏或喷5%醋酸镁甲醇溶液，斑点显红色。•观察记录：记录图谱并计算Rf值。