实验七-叶绿体色素的提取分离及理化性质的鉴定

实验七叶绿体色素的提取及理化性质的鉴定一、目的1、学习应用提取分离叶绿体色素的实验方法。2、验证叶绿素的理化性质。3、了解叶绿体色素的荧光现象、皂化反应等理化性质。二、原理1、叶绿体色素：植物叶绿体色素主要有三类：1）叶绿素2）类胡萝卜素3）藻胆素。高等植物叶绿体中含有前两类，藻胆素仅存在于藻类植物中。高等植物体内叶绿素（chlorophyll两种）主要有两种：叶绿素a、b（简写为chla、chlb，其结构式见图7-3），chla通常呈蓝绿色，而chlb呈黄绿色，chlb是chla局部氧化的衍生物。chla是chlb的三倍，二十世纪30年代，知道了叶绿素的分子结构，50年代末期，人工合成了叶绿素a，其它色素也几乎在同时发现。叶绿体中的类胡萝卜素主要包括胡萝卜素（carotene）和叶黄素（lutein）两种，前者呈橙黄色，后者呈黄色。叶黄素是胡萝卜素的二倍。一般植物叶绿素是类胡萝卜素的三到四倍；胡萝卜素：C40H56（有α、β、γ三种同分异构体）叶黄素：C40H54（OH）2(同分异构体很多)。2、理化性质：这二大类四种色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮等。通常用80%的丙酮或丙酮：乙醇：水为4.5：4.5：1的混合液来提取叶绿素。按化学性质来说，叶绿素是叶绿酸的酯，在碱的作用下，可使其酯键发生皂化作用，生成叶绿酸的盐，能溶于水，但由于它保留有Mg核的结构，仍保持原来的绿色。而类胡萝卜素中，胡萝卜素是不饱和的碳氢化合物，β—胡萝卜素水解可生成2分子维生素A，叶黄素是由胡萝卜素衍生的二元醇，不能与碱发生皂化反应，根据这一点，可以将叶绿素和类胡萝卜素分开。此外，叶绿素还可以在酸的作用下，其中的Mg被H所代替形成褐色的去Mg叶绿素：去Mg叶绿素能与其他金属盐中的铜、锌、铁盐等代H，又重新呈现绿色，比原来的绿色更稳定。根据这一原理可用醋酸铜处理来保存绿色标本。3、功能：1．叶绿体色素的功能叶绿素和类胡萝卜素都包埋在类囊体膜中，与蛋白质结合在一起，组成色素蛋白复合体，根据功能来区分，叶绿体色素可分为二类：（1）作用中心色素：叶绿素分子含有一个卟啉环的“头部”和一个叶绿醇的“尾部”，呈蝌蚪型，大卟啉环由四个小吡咯环以四个含有双键的甲烯基（-CH=）连接而成。镁原子居于卟啉环的中央，偏向于带正电荷，与其相联的氮原子则偏向于带负电荷，因而其“头部”具有极性，是亲水的，可以与膜上的蛋白质结合；而其“尾部”是叶绿酸的双羧基被甲醇和叶醇所酯化后形成的脂肪链，具疏水亲脂性，可以与膜上的双卵磷脂层结合，因此，这决定了叶绿素分子在类囊体膜上是有规则的定向排列。极少数具特殊状态的chla分子，其卟啉环上的共轭双键易被光激发而使电子与电荷分离，引起光能转化为电能的重要反应，因此这些chla分子是光合作用的重要色素，称“作用中心色素”；（2）天线色素（聚光色素）：没有光化学活性，只有收集光能的作用，包括大部分chla和全部chlb、胡萝卜素、叶黄素。这些色素排列在一起，象漏斗一样，把光传递集中到作用中心色素，引起光化学反应。类胡萝卜素还是一种保护性色素，在光过强时，可耗散过剩激发能，消除活性氧自由基，防止光合器官被氧化损伤。3、形成条件：叶绿素的形成叶绿素在植物体内，能不断的进行新陈代谢，如菠菜的叶绿素72小时更新95.8%；烟草19天后更新50%，其合成与分解受植物遗传控制（如吊兰叶的白边），也与环境关系密切。高等植物的叶绿素形成可以分为两个阶段，第一个阶段：主要是由α-酮戊二酸（或由其和氨形成的谷氨酸）经过一系列复杂的生化反应合成叶绿素的前身物质—无色的原叶绿酯；第二个阶段：原叶绿酯在光下被还原，成为绿色的叶绿素。叶绿素形成的条件1．光照光是叶绿素形成的必要条件，原叶绿素必须经过光照后才能合成叶绿素。缺乏光照或其他某些条件，影响叶绿素形成，使叶子发黄的现象，称黄化现象。由于黄化部位，机械组织不发达，肉质细嫩，生产上常用于遮光培育韭黄、蒜黄、葱白等；而光太强对叶绿素也不利，会使叶绿素氧化、褪色、去镁，并形成对膜有害的自由基。有些植物或植物部分无光照条件也能形成叶绿素，如松、柏，莲子胚芽等，推测这些植物中含有代替可见光促进叶绿素合成的物质。2．温度温度主要通过影响叶绿素合成酶的活性而影响叶绿素的合成。一般叶绿素形成的最低温度为2～4℃，最适26-30℃左右，最高约40℃。早春植物幼芽、叶呈黄绿色，是低温影响了叶绿素的形成的缘故。3．矿质营养矿质元素对叶绿素形成也有很大影响。N和Mg是叶绿素的组成成分，Fe、Mn、Cu、Zn等在叶绿素合成过程中也是必不可缺少的元素，缺少这些元素会引起缺绿症。特别是氮素，植株体内氮水平高低可影响叶绿色的深浅，生产上以此来判断氮肥的丰缺。4．水分和氧气植物缺乏水和O2，不仅抑制叶绿素的形成，还会促进原有叶绿素的分解。所以严重高温、干旱缺水和涝害缺O2时，叶子常表现黄色褪绿现象。由于叶绿素的形成受许多条件的影响，所以叶色是反映植物的营养情况和健康状况的一个很灵敏的指标，成为肥水管理和调控作物生长发育的依据之一。5、提取：叶绿体色素为有机酯类化合物，根据相似相容原理，常用有机溶剂提取。如酒精、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等。分离：薄层层析法是将吸附剂均匀的涂抹在玻璃板上形成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待测分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂中。流动相通过毛细管作用由下而上逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组成分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、脱吸附、再吸附……的过程。由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附能力强的物质相对移动慢一些，儿媳妇能力弱的物质相对移动快一些，从而使各组分有不同移动速度而彼此分开。叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类,这两类色素都不溶于水,而溶于有机溶剂,故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取.提取液可用色层分析的原理加以分离.因吸附剂对不同物质的吸附力不同,当用适当的溶剂推动时,混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数,所以它们的移动速度不同,经过一定时间层析后,便将混合色素分离.叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯,故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐,产生的盐能溶于水中,可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性,叶绿素吸收光量子而转变成激发态,激发态的叶绿素分子很不稳定,当它变回到基态时可发射出红光量子,因而产生荧光.叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素,后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素,铜代叶绿素很稳定,在光下不易破坏,故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。6、叶绿素是一种有叶绿酸与甲醇形成的复合酯，故可发生皂化反应。叶绿素化学性质不稳定，见光分解。叶绿素中的Mg可以被H+代而形成褐色的去镁叶绿素，去镁叶绿素遇铜则变成铜带叶绿色。纸层析法测定叶绿素纸层析是用滤纸作为载体的一种色层分析法，其原理主要是利用混合物中各组分在；流动相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分离。滤纸上吸附的水为固定相（滤纸纤维常能吸20%左右的水），有机溶剂如乙醇等为流动相，色素提取液为层析试样。把试样点在滤纸的滤液细线位置上，当流动相溶剂在滤纸的毛细管的作用下，连续不断地沿着滤纸前进通过滤液细线时，试样中各组份便随着流动相溶剂向前移动，并在流动相和固定相溶剂之间连续一次有一次的分配。结果分配比比较大的物质移动速度较快，移动距离较远；分配比较小的物质移动较慢，移动距离较近，试样中各组分分别聚集在滤纸的不同的位置上，从而达到分离。叶绿素等是脂溶性的有机分子，根据相似相溶的原理，叶绿素等色素分子溶于有机溶剂而不溶于有极性的水。故在研磨和收集叶绿色素时要用丙酮或乙醇等有机溶剂而不用水。叶绿素分布于基粒的片层薄膜上，加入少许二氧化硅是为了磨碎细胞壁、质膜、叶绿体被膜和光合片成，使色素溶解于丙酮中。3.破碎的细胞中含有草酸等有机酸，叶绿素分子中含有的Mg元素处于不稳定化合态，镁离子与有机酸结合将导致色素分子破坏。加入少许碳酸钙使得钙离子与有机酸结合，减少镁离子的转移，防止研磨时叶绿体色素的破坏。所以在研磨时加入适量的碳酸钙，同时加入碳酸钠的道理亦如此。在过滤时选用脱脂棉或纱布，而不用滤纸。原因主要有下：（1）色素分子比较大，不容易透过滤纸；（2）滤纸有较强的吸附性而使色素吸附在滤纸上，从而降低色素浓度，影响实验效果；（3）叶绿素是脂溶性，根据相似相容的原理，脱脂棉可以减少实验过程中色素的流失，增强实验效果。根据物理学中的毛细现象，画滤纸细线前滤纸必须经过干燥处理，是为了阻止水分子堵塞滤纸中的毛细管而影响层析液的扩散。但如果用火烤的话，会使滤纸纤维变形同时破坏啦毛细管，而影响层析液的扩散。沿滤纸边缘扩散过快，而导致色素带分离不整齐的现象。故而，在插入层析液的滤纸条一端剪去两个角。沿滤纸条向上的“壁流”而导致色素溶解。色素分离的原理：纸层析是用滤纸作为载体的一种色层分析法，其原理主要是利用混合物中各组分在；流动相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分离。滤纸上吸附的水为固定相（滤纸纤维常能吸20%左右的水），有机溶剂如乙醇等为流动相，色素提取液为层析试样。把试样点在滤纸的滤液细线位置上，当流动相溶剂在滤纸的毛细管的作用下，连续不断地沿着滤纸前进通过滤液细线时，试样中各组份便随着流动相溶剂向前移动，并在流动相和固定相溶剂之间连续一次有一次的分配。结果分配比比较大的物质移动速度较快，移动距离较远；分配比较小的物质移动较慢，移动距离较近，试样中各组分分别聚集在滤纸的不同的位置上，从而达到分离的目的。物理：叶绿素是植物进行光合作用的主要色素,是一类含脂的色素家族叶绿素,位于类囊体膜.叶绿素吸收大部分的红光和紫光但反射绿光,所以叶绿素呈现绿色,它在光合作用的光吸收中起核心作用.叶绿素为镁卟啉化合物,包括叶绿素a、b、c、d、f以及原叶绿素和细菌叶绿素等.叶绿素不很稳定,光、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解.酸性条件下,叶绿素分子很容易失去卟啉环中的镁成为去镁叶绿素.叶绿素有造血、提供维生素、解毒、抗病等多种用途。化学性质：高等植物叶绿体中的叶绿素主要有叶绿素a和叶绿素b两种.它们不溶于水,而溶于有机溶剂,如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等.叶绿素a分子式：C55H72O5N4Mg；叶绿素叶绿素荧光仪。b分子式：C55H70O6N4Mg.在颜色上,叶绿素a呈蓝绿色,而叶绿素b呈黄绿色.按化学性质来说,叶绿素是叶绿酸的酯,能发生皂化反应.叶绿酸是双羧酸,其中一个羧基被甲醇所酯化,另一个被叶醇所酯化。高等植物叶绿体中的叶绿素主要有叶绿素a和叶绿素b两种。它们不溶于水，而溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等。叶绿素a分子式：C55H72O5N4Mg；叶绿素叶绿素荧光仪b分子式：C55H70O6N4Mg。在颜色上，叶绿素a呈蓝绿色，而叶绿素b呈黄绿色。按化学性质来说，叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应。叶绿酸是双羧酸，其中一个羧基被甲醇所酯化，另一个被叶醇所酯化。叶绿素分子含有一个卟啉环的“头部”和一个叶绿醇的“尾巴”。镁原子居于卟啉环的中央，偏向于带正电荷，与其相联的氮原子则偏向于带负电荷，因而卟啉具有极性，是亲水的，可以与蛋白质结合。叶醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪链，它决定了叶绿素的脂溶性。叶绿素不参与氢的传递或氢的氧化还原，而仅以电子传递（即电子得失引起的氧化还原）及共轭传递（直接能量传递）的方式参与能量的传递。卟啉环中的镁原子可被氢离子、铜离子、锌离子所置换。用酸处理叶片，氢离子易进入叶绿体，置换镁原子形成去镁叶绿素，使叶片呈褐色。去镁叶绿素易再与铜离子结合，形成铜代叶绿素，颜色比原来更稳定。人们常根据这一原理用醋酸铜处理来保存绿色植物标本。叶绿醇是亲脂的脂肪族链，由于它的存在而决定了叶绿素分子的脂溶性，使之溶于丙酮、酒精、乙醚等有机溶剂中。由于在结构上的差别，叶绿素a呈蓝绿色，b呈黄绿色。在光下易被氧化