第六章疫苗制造基本程序新

第六章疫苗制造基本程序规疫苗主要是细菌性的菌苗、病毒性的疫苗和寄生虫疫苗三类，其制造程序、疫苗性质和免疫程序各不相同。获得质量优良、安全的产品，关键环节如下：1.选择优良的菌种和毒种，并保持其稳定性；2.选用适当的培养繁殖细菌与病毒等微生物的方法，包括优良的培养基、合乎要求的最好是标准化的实验动物、禽胚及细胞；3.熟练掌握制品的生产工艺；4.准确掌握产品的检验方法和判定标准，严格按标准进行质量检定。一、细菌性灭活疫苗制造细菌性灭活疫苗简称灭活菌苗，种类、苗型甚多，但制造的基本程序差别不大。（一）菌种与种子1.菌种制苗用菌种多数为毒力强、免疫原性优良的菌株，通常使用1-3个品系，均由中国兽药监察所传代、鉴定、冻干保存和供应。各种用于制造菌苗的菌种应按规定定期复壮，并进行形态、培养特性、菌型、抗原性和免疫原性鉴定，合格菌种准许用于制苗。2.种子培养将经鉴定符合标准的菌种接种于菌苗生产规程中所规定的培养基进行增殖培养，经纯粹检查、活菌计数达到标准后即为种子液，用于菌苗生产。种子液通常保存于2-8C冷暗处，不得超过规程规定的使用期限。（二）菌液培养大量生产的细菌培养方法甚多，既有手工式的，也有机械化或自动化的培养方式。机械化或自动化的培养方式通称为反应缸培养法，可供选择的菌液培养法有：液体静置培养法、液体深层通气培养法、透析培养法及连续培养法等。菌液培养也可采用固体培养法，该方法易获得高浓度的细菌悬液，易稀释成不同浓度，且含培养基的成分较少，所以比较适用于制备诊断用的抗原。（三）灭活灭活菌苗通常根据细菌的特性加入最有效的灭活剂，采取最适当的灭活条件进行，几种灭活菌苗的灭活方法如表6-1所示。菌苗菌或毒素灭活方法猪丹毒氢氧化铝菌苗猪丹毒杆菌菌液加入甲醛至0.2%-0.5%，37C杀菌18-24h。气肿疽甲醛菌苗气肿疽梭菌菌液加甲醛至0.5%，37-38C杀菌72-96h。破伤风类毒素破伤风梭菌菌液上清加甲醛至0.4%，37-38C脱毒21-30d。肉毒梭菌C型菌苗（菌体毒素苗）C型肉毒梭菌菌液加加入甲醛至0.8%，37C杀菌脱毒18d。表6-1几种灭活菌苗的灭活方法（四）浓缩为提高某些灭活菌苗的免疫力，在培养过程中采取提高菌数的基础上，再通过浓缩方法达到目的。常用的浓缩方法：氧化铝胶吸附沉淀法离心沉降法羧甲基纤维沉淀法以上方法可使菌液浓缩一倍以上。此外，有些细菌在生长过程中产生分子量小的可溶性抗原（如猪丹毒杆菌产生的糖蛋白）也可经氢氧化铝吸附浓缩；将破伤风脱毒液按盐酸—食盐法处理，以作进一步精制成提纯破伤风类毒素。（五）配苗与分装由于灭活菌苗所用的佐剂不同，所以配苗方法也不相同。猪肺疫氢氧化铝菌苗：可在加入甲醛灭活的同时，按比例加入氢氧化铝胶配制；也可在菌液经甲醛灭活后再按比例加入氢氧化铝胶配苗。有的厂家禽霍乱油佐剂菌苗的配制程序为：于灭菌的油乳剂135m110号白油、11.4m1Span-85、3.6mlTween80混合液中，在边搅拌下加入等量甲醛灭活菌液配制。配苗和分装：应充分混匀，及时塞塞、贴签或印字。二、细菌性活疫苗制造弱毒菌种多系冻干品，由中国兽药监察所传代、鉴定、保存与分发，少数由国家指定单位鉴定、保存与供给。菌种使用前应按规程规定进行复壮、挑选，并作形态、特性、抗原性和免疫原性鉴定，符合标准后方可用于制苗。将检定合格的菌种接种子于规定的培养基，按规定的条件增殖培养，经纯粹检查及有关的检查合格者即可作为种子液。种子液通常在0～4C可保存2个月，在保存期内可作为菌苗生产的批量种子使用。细菌性活疫苗多指弱毒菌苗，尽管种类与苗型甚多，但基本制造程序相同。（一）菌种与种子按1%～3%量将种子液接种于培养基，然后依不同菌苗要求进行培养。如猪丹毒弱毒菌须在在深层通气培养中加入适当植物油作消泡剂，通入过滤除菌的热空气进行培养制造菌液；又加布氏杆菌猪2号与羊5号弱毒菌经固体表面培养完成后须按规定要求将菌苔洗下制成菌液。菌液于0～4C暗处保存，待抽样经纯粹、活菌数等检查合格后使用。（二）菌液培养为提高某些弱毒菌苗的免疫效果，可进行浓缩，以提高单位活菌数，常用的依缩方法有吸附剂吸附沉降法、离心沉降法等，如于猪丹毒菌液内加入0.2%～0.25%羧甲基纤维素(CMC)进行浓缩，也可用离心沉淀浓缩。浓缩菌液应抽样作纯粹、活菌数等检查。（三）浓缩经检验合格的菌液，按规定比例加入保护剂配苗，充分摇匀后随即进行分装，分装量必须准确。分装好的菌苗迅速送入冻干柜进行预冻、真空干燥，冻于完毕后立即加塞、抽空、封口，移入冷库保存，并由质检部门抽样检验。（四）配苗与冻干流程图1——细菌疫苗和类毒素制造工艺流程蛋白质、肉浸液等原料培养基细菌分离菌种弱毒菌种配置、灭菌鉴定减毒滤过脱毒纯化加吸附剂吸附检验配制灭菌检验检验配制灭菌原料佐剂灭活菌液配苗、乳化灭活疫苗培养菌苗原液配苗活疫苗保护剂类毒素毒素纯化类毒素菌液分装、冻干分装灭活原料精制类毒素活化种子三、病毒性动物组织疫苗制造病毒在易感动物体内可大量增殖，但在各器官组织、部位中增殖病毒的量却有很大的差异，利用病毒增殖迅速、含毒量高的组织制造的疫苗称为组织疫苗(tissuevaccine)。动物组织疫苗包括动物组织灭活疫苗和动物组织弱毒活苗两类，前者多数由强毒株制造，如猪瘟结晶紫疫苗、狂犬病羊脑组织疫苗；后者均以弱毒株生产，如猪瘟兔化弱毒乳兔组织疫苗、牛瘟兔化弱毒组织疫苗等。动物质量直接影响到组织疫苗的质量，特别是对疫苗的安全性和效力有着决定性的作用，动物必须符合下列标准：(1)应该是清洁级(二级)以上的等级实验动物，即无规定的人兽共患性病原体动物；(2)应是对所接种病毒易感性高的动物，即在品种、年龄和体重方面合乎要求的实验动物。（一）动物选择种毒既可用抗原性优良、致死力强的自然毒株脏器组织毒或强毒株增殖培养物，也可用弱毒株组织毒种。无论何种种毒都须经纯粹、抗原性和免疫原性检查合格后使用。接种途径依病毒性质和目的而异，例如猪瘟结晶紫苗，采取猪肌肉注射血液毒种；牛瘟兔化弱毒疫苗，以兔耳静脉注射脾淋毒种；狂犬病疫苗，用兔脑毒种接种绵羊脑内途径感染。几种动物常用的接种途径如下：1.脑内注射：颅前后中线5mm平行线与瞳孔横线交叉处。2.静脉注射：家兔由耳静脉注入；鸡自翅下肢静脉注入。3.肌肉注射：选择腿部、胸部、臀部等肌肉丰满处注射。4.皮下注射：家兔和豚鼠可选择在腹部或后腿内注射。5.腹腔注射：家兔与豚鼠可选腹股沟处刺入腹腔。（二）种毒与接种动物在接种感染后应每天观察和检查规定的各项指标，指标或项目因不同病毒而异。常规观察、检查的项目如食欲、精神和活动状态、体温、粪便、尿和血液变化等。根据观察的征象和检查的结果选出符合要求的发病动物按规定方式剖杀，采取收集含毒量高的器官组织。如猪瘟结晶紫疫苗采取发病猪的血液制备；兔出血症组织灭活疫苗采集病兔肝脏生产；狂犬病疫苗利用发病羊的羊脑组织制造。（三）观察与收获1．组织灭活疫苗采取收获的组织经无菌检验及毒价测定合格后，按规定比例加入平衡液和灭活剂（甲醛、酚、结晶紫等）制成匀浆，然后按不同病毒的灭活温度、时间进行灭活。如狂犬病疫苗配制按脑组织1:4加入含有甘油及1%酚蒸馏水，于360.5C灭活7天制成；猪瘟结晶紫疫苗配制，按血毒4份，结晶紫甘油溶液1份混合，于37C~38C灭活6~8天。2.弱毒组织疫苗在无菌操作下剔除脏器上的脂肪与结缔组织等，称重后剪碎，加入适最保护剂制成匀浆，然后滤过扣除残渣量，再按滤液中的实际组织量计算稀释倍数，加入余量保护剂和青链霉素500~1000U(g/ml)，充分摇匀后置0~4C冷暗处处理一定时间后作无菌检验与毒价测定。合格者进行分装，冷冻真空干燥制成冻干疫苗。（四）制苗流程图2——病毒性组织疫苗制造工艺流程动物感染动物毒株种毒灭活病毒液鉴定培育检验检验配制原料佐剂配苗、乳化灭活疫苗含病毒组织含病毒悬液配苗活疫苗保护剂分装、冻干分装灭活原料种子扩增收获配制纯化病毒悬液接种四、病毒性禽胚培养疫苗制造受精卵必须来自SPF鸡群，至少源于未用抗生素药物的非免疫鸡群，以免受母源抗体的干扰和残留抗生素的影响。从受精卵入孵开始至培养全过程都应保持无菌，要求一定的温度和湿度，且需不断翻动，然后选择。选择一定日龄、发育正常的胚用于接毒培养，5~8日龄胚适用于卵黄囊接种；9~11日龄胚用于尿囊腔接种；10~12日龄胚适于羊膜腔接种；11~12日龄胚用于绒毛尿囊膜接种。痘病毒、正粘病毒、副粘病毒和疱疹病毒等一类生物制品，目前仍然利用禽胚特别是鸡胚制备，如鸡新城疫苗、鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗、犬瘟热鸡胚弱毒疫苗等。禽胚疫苗生产的原材料来源方便、质量比较容易控制，制造程序简单，不需要过高的设备条件，生产的疫苗质量可靠。（一）鸡胚选择（二）种毒与毒种继代目前适应于鸡胚的种毒多系弱毒，包括自然弱毒与人工培育的弱毒两类。各种制苗用的种毒多数由国家菌毒种保藏部门或指定单位保存，保存的种毒多为冻干毒。冻干毒种需按规定要求在鸡胚继代复壮，通常继代3代以上，经检定符合标准后方可作力生产疫苗的毒种，毒种检定内容包括无菌检验、毒价测定和其他项目的检定等。（三）接毒与收获鸡胚接毒涉及接毒途径和接毒量两方面。根据不同的病毒与不同疫苗生产程序，选择最佳接种途径和接种量。接种途径：绒毛尿囊膜接种尿囊腔接种羊膜腔接种卵黄囊接种如鸡新城疫I系和II系毒采取尿囊腔接毒，前者接种10~3稀释毒种0.1ml，后者接种10~4稀释毒种0.1ml。鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗采用绒毛尿囊膜接种50-100倍稀释毒0.2ml。1.接毒鸡胚接毒后培养增殖的时间和温度、湿度以及收获的标准与内容物依不同的病毒和不同的疫苗而异。如鸡新城疫I系疫苗，接毒后于38.5~39C、相对湿度60%~70%条件培养增殖，收集接毒后24~48h内死亡胚，置0~10C冷却4~24h，收获胚液，进行无菌检验，供制备湿苗用。也可收获胚液、胎儿及绒毛尿囊膜混合制成乳剂制备冻干苗。鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗，则收集接毒后48~120h内死亡的鸡胚，冷却后采取绒毛尿囊膜、尿囊液、胎儿制造冻干苗用。2.培养收获按规定收获的胚液、胎儿和绒毛尿囊膜乳剂经无菌检验合格后即可进行配苗。1.湿苗通常于鸡胚液内，按每毫升加入青霉素和链霉素500~1000U，放置0~10C冷暗处处理后分装。2.冻干苗经无菌检验后合格的胚液或胚液、胎儿、绒毛尿囊膜乳剂，按比例加入保护剂，充分混合后滤过，于滤液内按每毫升加入青、链霉素500~1000U，混合后分装冻干。3.灭活苗收获鸡胚液经无菌检验及毒价测定合格后，按规定比例加入平衡液，按不同病毒的灭活温度、时间进行灭活，加入相应的佐剂，制备成灭活疫苗，放置4-10C保存。（四）配苗流程图2——病毒性组织疫苗制造工艺流程受精卵禽胚毒株种毒灭活病毒液鉴定培育检验检验配制原料佐剂配苗、乳化灭活疫苗含病毒尿囊液或禽胚组织含病毒悬液配苗活疫苗保护剂分装、冻干分装灭活原料种子扩增收获配制纯化病毒悬液接种五、病毒性细胞培养疫苗制造用于制苗用的种毒应经毒力、最小免疫量、安全性、无菌检定合格，通常为冻干品，由国家指定的苗毒种保藏部门检定分发。领取的种毒应按规定在细胞继代培养适应后用作毒种，制苗用毒种应按规定控制在一定代数以内，或为湿毒毒种，或为冻干毒种。细胞培养疫苗有细胞培养灭活疫苗和细胞培养活疫苗两类，前者多以强毒毒株培养增殖制造，后者则用弱毒毒株增殖生产，两者的制造程序既有相同之处，又有区别。由于病毒不同与疫苗性质不同，所采用的细胞及细胞培养方法也有所不同（一）种毒与毒种继代1907年美国生物学家Harrison，在无菌条件下以淋巴液为培养基成功地在试管中培养了蛙胚神经组织达数周，创立了体外组织培养法。在随后的近一个世纪里，随着细胞生物学、培养系统及培养方法等领城的不断丰富和完善，动物细胞培养技术得到了很大的发展。发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。大规模动物细胞培养在生物技术产业化进程中显示出强大的潜力。(