微滴度PCR(ddPCR)的原理和最新应用

陈燕飞，Ph.D.FieldApplicationSpecialist,Bio-RadLaboratories第三代PCR技术——ddPCR的原理和医学应用ddPCRdropletdigitalPCR微滴式数字PCR主要内容ddPCR的基本原理ddPCR的技术特征ddPCR的医学介绍（ddPCR，dropletdigitalPCR，微滴式数字PCR）主要内容ddPCR的基本原理（什么是数字PCR？什么是微滴式数字PCR/ddPCR?）PCR技术的发展历程（1983-2015年）普通PCR定性分析Real-timePCR间接定量分析（依赖Ct或Cq值，标准品）数字PCR直接定量分析（无需标准品，绝对定量）第一代第二代第三代T100ThermalCyclerCFX96/384Real-timePCRQX200DropletDigitalPCR更灵敏更准确更精确第三代PCR技术——数字PCR（digitalPCR,dPCR）阴性微滴比例推算起始靶分子的绝对量泊松分布一个待分析的PCR反应体系基本原理：0或1的反应（以ddPCR为例）成千上万个独立的PCR反应体系:靶标分子:背景分子有限稀释PCR扩增●:阳性微滴（1）○:阴性微滴（0）泊松分布数字PCR的核心思想1992年数字PCR思想的提出利用有限稀释，终点PCR和泊松分布实现核酸浓度的绝对定量Thecombinationoflimitingdilution,end-pointPCR,andPoissonstatisticscouldyieldanabsolutemeasureofnucleicacidconcentration.AlecMorley今天数字PCR的应用发展就像1990年代末real-timePCR的发展（NatureMethod，2014）(JoVandesompele)PCR技术发展的一种趋势数据来源：GoPubMed，2016年6月11日更新基于微滴的数字PCR——微滴式数字PCR（ddPCR）QX200AutoDGddPCR（目前市场上唯一的数字PCR自动化产品）QX200ddPCR（QX100ddPCR的升级版，同时兼容染料法和水解探针法检测）ddPCR的工作流程：QX200ddPCR手动操作步骤自动操作步骤视频：QX200ddPCR的工作流程ddPCR的工作流程：QX200AutoDGddPCR手动操作步骤自动操作步骤手动操作步骤自动操作步骤视频：QX200AutoDGddPCR的工作流程ddPCR的技术特征（ddPCR与real-timePCR等现有技术有什么不同和进步？）Real-timePCR，castPCR，array，NGS，FISH，CE……ddPCRvsddPCR技术特征（一）：微滴化可实现稀有序列的富集总反应体积–20μL40,000个背景核酸（野生型）40个靶基因（突变型）靶基因（突变）丰度0.1%ddPCR可以实现痕量核酸的高灵敏检测微滴化分割样品–20,000×1nL40个微滴含2个背景核酸19,960个微滴含2个背景核酸靶基因丰度33%+1个靶基因ProbespecificassayschemeWTMUTFR1%mutant0.01%mutant0.1%mutant0.005%mutant0%mutant(wildtypeonly)0.001%mutant高含量野生型DNA背景下BRAFV600E稀有突变的ddPCR检测（AnalChem83,8604）（DNA定量分析/肿瘤突变分析/基因分型）ddPCR技术特征（一）：微滴化可实现稀有序列的富集ddPCR的技术特征（二）：优秀的准确度、精密度和重复性（by中国计量科学院）（DNA定量分析、绝对定量）PrecisionIndependentlyVerifiedandObserved,+/-1.5%UncertaintyOverTheoreticalValueGravimetricExperimentsConductedatNationalMeasurementInstitute,NSW(Australia)（by澳大利亚国家计量院）（DNA定量分析、绝对定量）（肿瘤相关microRNA定量分析、方法学对比）ddPCR的技术特征（二）：优秀的准确度、精密度和重复性ddPCR的技术特征（三）：对PCR抑制剂的容忍度更高背景：验证抑制剂对ddPCR反应结果的影响方法：采用经验证的CMVqPCR体系对UL123和UL55进行扩增，并加入SDS、EDTA和肝素作为抑制剂（DNA定量分析/病毒检测/临床复杂样本的检测）ddPCR的技术优势——成功应用的起点能够检测含量极低的核酸序列灵敏度可达单个核酸分子，检测限低至0.001%，原因在于微滴化步骤可以实现靶标DNA/RNA的富集无需标准品（标准曲线），即可对靶分子起始量进行绝对定量特别适合基质复杂样品的检测终点PCR检测，不依赖Ct值，不依赖扩增效率，能克服PCR抑制剂的影响；适合动血样、FFPE组织、粪便、尿液、痰液、水样、土壤、植物等复杂样品中DNA的绝对定量能够有效区分浓度差异（变化）微小的样品更好的准确度、精密度和重复性，可以用于精确测定靶基因的相对表达，基因拷贝数变异分析等ddPCR的医学应用介绍（基于已发表文献）（被验证、可重复、有创新性的案例）(应用文献仅限英文研究性文章，不含综述、图书等)ddPCR的应用文献（1）总体研究水平较高；（2）按年呈倍数增加基于文献的ddPCR应用介绍——应用文献情况统计ddPCR的最新应用分类研究思路参考ddPCR的应用介绍（1）——痕量核酸检测痕量核酸检测稀有序列检测(RSD)（待测序列与背景核酸不相似）•病原微生物检测•环境和分子生态•转基因分析稀有突变检测(RMD)（待测序列与背景核酸（野生型DNA）高度相似）•肿瘤突变检测•产前诊断•器官移植痕量核酸检测相关方法比较MethodSensitivityNbofTargetsThroughputCostAbs.QuantqPCR+++++++Low+CAST-PCR+++++++HighNASanger/CE++++++LowNANGS++++++VeryHighNAddPCR+++++++++Moderate++++ddPCR尤其适合：对灵敏度要求非常高的核酸痕量分析研究基质复杂样品中的核酸准确定量（如组织、体液、排泄物、土壤、水环境等样品）难题:EGFR突变的肺癌治疗过程中的肿瘤活检采样是一项很有挑战性的工作，越早的突变检查越有利于治疗对策:ddPCR可以EGFR突变的肺癌患者的血浆中游离DNA（cfDNA）为样本，检测与EGFR敏感性和药物抗性相关的突变ddPCRassaysforEGFR,KRAS,BRAFmutationsweredevelopedusingplasmacollectedfrompatientswithadvancedlungcancerormelanomaofaknowngenotype.案例1：肿瘤相关血浆中的cfDNA稀有序列检测（无创检测）KeyFindings:PlasmalevelsofmutantEGFRin9patientsreceivingfirst-lineerlotinibuntilobjectivediseaseprogression(PD)ddPCRofcfDNAallowshighlyspecific&quantitativeassessmentoftumorgenotype•Allpatients:plasmalevelsoftheEGFRsensitizingmutation(−)dropinresponsetotreatment,8patientshadcompleteresponse.•6patients:plasmagenotypelevelsreemergeupto4monthspriortoPD,lowerconcentrationofT790M(---)isalsodetected.•3patients:plasmagenotypenotdetectedattimeofPD;all3hadindolentprogressioninchestonly.案例1：肿瘤相关血浆中的cfDNA稀有序列检测（无创检测）案例2：肝癌患者体内乙肝病毒HBV的拷贝数检测通讯作者：武汉大学中南医院医学科学研究中心刘松梅老师研究内容：探索HBV血清学和ddPCR检测结果与肝细胞癌（HCC）临床分期和病症之间的关系技术突破：ddPCR成功的克服了real-timePCR在检测FFPE处理的肝癌患者组织样品中HBVDNA时，遇到的准确度、灵敏度和重复性不足的缺点实验结论：1、ddPCR的灵敏度和准确度比real-timePCR更高——131个待测样品中HBVDNA浓度范围为1.1~175.5copies/ul；2、即使是在24个血清学检测呈阴性的样本中也检测到了痕量的HBVDNA；3、样品中HBVDNA的含量与肝细胞癌（HCC）组织的临床分期一致（tumor-nodes-metastasis(P=0.008)，Barcelona-ClinicLiverCancer(P=0.045)）；4、ddPCR技术可以用于肝癌的早期无创诊断，病程监控，肝移植、化疗或免疫抑制的疗效评估。（通讯单位：武汉大学中南医院）案例2：肝癌患者体内乙肝病毒HBV的拷贝数检测生化危机与拯救人类案例3：ddPCR用于致命病毒的检测ddPCR在美剧中的应用（TheLastShip）相对定量基因表达分析RNA定量分析mRNA、microRNA、lncRNA……ddPCR的应用介绍（2）——基因表达分析基因表达分析相关方法比较MethodPrecisionNbofTargetsThroughputCostAbs.QuantRT-qPCR+++++++Low+Array+++++HighNARNA-Seq++++++VeryHighNANanoString++++++High++ddPCR++++++++Moderate++++ddPCR尤其适合：基因相对表达变化差异较小（2倍）的研究低丰度基因或单细胞的表达分析，以及RNA编辑、等位基因差异表达等研究案例1：干细胞分化过程中的microRNA定量分析WhileqRT-PCRworkswelltocharacterizelargechanges(FigA),butddPCRisneededwhenthedifferencesaremoresubtle(FigB)qRT-PCRddPCR(YaleUniversitySchoolofMedicine)热休克蛋白在环境胁迫响应中的作用，及其与神经紊乱的关联来自精神分裂症（SZ）患者的神经前体细胞（NPC），在面对环境刺激（酒精、甲基汞）时，HSP70的表达量会上升单细胞ddPCR定量HSP70mRNA案例2：单细胞基因表达分析单细胞中HSP70基因相对表达定量Thesingle-cellequivalentsweremadebyusing1/10ofapooloftenlysedcellsforthetemplateofreversetranscription(tenbiologicalreplicateswereused).ddPCR的应用介绍（3）——CNV分析CopyNumberVariation(CNV)拷贝数变异分析（相对定量分析）个体间某基因组片段的拷贝数多态性，从1Kb到数百万个碱基，新一代遗传标记；拷贝数变异与疾病（癌症）、代谢途径、生物种进化等关系密切；临床上，CNV可为具体治疗方案的制定与修正提供参考；农业及畜牧业，CNV可作为遗传育种的遗传标记。CNV的生物学意义拷贝数变异分析相关方法比较MethodSensitivityNbofTargetsThroughputCostLinkageqPCR++++++Low+FISH+++High++CGHArray++++++High+