第五章透射电子显微镜生物样品制备技术

第五章透射电子显微镜生物样品的制备技术通过前段的学习大家已知到，电子显微镜可分为透射和扫描两种，它们的成像原理是完全不同的。透射电镜的成像是和光学显微镜的原理基本相同，因此它只能观察薄片样品和微颗粒样品，它主要是用来观察研究组织或细胞的内部超微结构。而扫描电镜是电子束在样品表面扫描激发出的二次电子转换成样品的图像，它既可以观察较大的块状样品也可观察颗粒样品。但它只能观察研究样品的表面形态结构。所以两种电镜的样品制备方法是完全不同的。第一节透射电子显微镜生物样品的超薄切片制备技术透射电镜的样品制备技术，主要有超薄切片技术、负染色技术和冷冻蚀刻复型技术。超薄切片样品制作技术，是透射电镜生物医学样品制备的最常用技术，其制作程序和石蜡切片的方法步骤基本相同，但是在所使用的某些化学试剂及切片机是完全不同的，对各技术步骤的操作要求要比石蜡切片严格很多。一个能满足透射电镜观察要求的超薄切片应具备以下几点：1、切片厚度均匀，厚度在50～70nm.2、切片无划痕、无震颤、无人工污染。3、耐高真空，在真空中不变形、不升华。4、耐电子束的轰击。根据上述要求，制作一个合格的超薄切片需要经过以下步骤：取材、固定（双固定）、清洗、脱水、置换、浸透、包埋、聚合、修块、超薄切片、捞片、电子染色。由于透射电镜是观察研究组织或细胞内的超微结构，也就是主要研究细胞器的内部结构，它对观察样品的要求十分严格。所以在样品的制备过程中一定要慎重的对待每一操作步骤，否则会造成实验结果的失败。因为有很多材料不能重复取材（如人的病理组织），所以一旦结果不好或失败，是不可彌补的。一、取材从动、植物体上获得所需实验材料的过程叫取材。1、取材的方法动物和植物的取材方法稍有不同。动物组织的取材：取动物材料时需要先处死动物，然后要在尽短的时间内（要求在１分钟之内）把所需要的组织取出放入预冷（40C）的固定液中，稍加固定后再切成适当大小的块(要求１立方毫米大小）；植物组织的取材：植物材料可直接切成适当大小的块，放入预冷的固定液中，如果材料漂在液体上面，需抽气让组织沉到液体的底部，以便使组织得到充分的固定游离细胞的取材：悬液培养的细胞需要离心获得细胞的沉淀物，然后再用预冷的固定液进行固定处理；贴壁培养的细胞要先想办法收集细胞团再进行固定处理。细菌的取材：取材方法基本和培养细胞的方，法相同。悬液培养的要离心获得细菌沉淀物进行固定，平板和斜面培养的可直接获得菌团进行固定。人体病理组织的取材：需提前做好准备，到手术室取材。2、取材的注意事项1）、取材的全过程要求在冷（40C）的环境中进行，所用的液体要提前进行预冷。2）、切割样品时要采取一刀切开的方法，不能用拉锯式切割法，尽量减少对样品的机械损伤。3）、样品的块要小，要求是1个立方毫米。这样可使样品在较短的时间内得到充分的固定。4）、如果所取样品的表面有污染物，动物材料要用冷的生理盐水洗；植物材料可用无离子水或自来水洗，但清洗的时间一定要短。二、固定用物理或化学的方法迅速杀死细胞的过程叫固定。1、固定的目的：保存细胞的精细结构，防止组织细胞的自溶；保护样品使其组成物质在以后的清洗、脱水和包埋过程中不至溶解和丢失，并使组织适度硬化，防止切片的变形。2、固定的方法：有物理固定法和化学固定法。1）、物理固定法：用高温、冷冻、干燥等物理手段，使细胞结构固定，一般不用。2）、化学固定法：用化学物质对细胞结构进行固定，是常用的方法。化学固定又可分为：（1）、单一固定法。即对样品只用一种固定剂进行固定，这种方法只是在一些特殊要求的样品制备中使用（如电镜细胞化学样品制备时），常规制样一般不使用。（2）、双重固定法。用两种或两种以上的性质不同的固定剂对同一种样品进行固定，这种方法是最常选用的。它可以相互彌补固定剂各自的不足，使细胞内的各种结构都得到充分的固定。（3）、原位固定法。主要用于动物深层组织取材过程中使用的方法，可以防止细胞的自溶。（4）、灌流固定法。也是在动物组织取材时选用的一种临时固定方法，从动脉向组织内灌注固定液，使组织在短时间内得到充分的固定，本方法适用于独立性好的器官取材时的的临时固定。3、影响固定效果的因素1）、固定液的PH值：固定液的PH值必须接近被固定样品的PH值。这样可以避免蛋白质结构和性质的变化，大部分的动物组织的平均PH值为7.4，选用PH值7.2~7.4较为适宜；植物组织常用pH值6.8～7.1固定液，固定效果较好。2）、固定液的浓度：固定液的浓度一定要合适，戊二醛的常用浓度为1～3％，锇酸一般为1～2％。3）、固定液的渗透压：一般堤身固定液可使细胞膨胀，而高身固定液可使细胞收缩。固定液的渗透压可通过改变缓冲液的浓度或增加纳、钙和镁等电解质或葡萄糖、蔗糖等非电解质来调节。4）、组织块的大小：组织块大固定的时间要长，固定效果差；组织块小，固定时间短固定效果好。5）、固定温度：为降低酶的活性，防止细胞的自溶，固定大都在4度中进行。4、常用固定剂的种类及溶液的配制1）、固定剂的选择:一种优良的固定剂应具备以下条件：渗透能力强；使蛋白质交联成稳定的凝胶，而蛋白质分子结构不发生明显的变化和凝集；能保存酶的一定活力和细胞内其它成分（核酸、核蛋白、糖元及脂类）；对细胞没有收缩和膨胀作用；对细胞不产生人工假象，并能提高电子反差。根据以上条件，适用于电镜样品固定的固定剂常见的有：戊二醛、锇酸、多聚甲醛、高锰酸钾等。（1）、戊二醛它是一种还原剂，分子量是100.12，商品是25％的水溶液。PH为4.0～5.0。它的穿透能力很强，是蛋白质的优良交联剂，对细胞膜系统、细胞骨架、糖元、核蛋白和细胞基质的固定效果较好。但不能保存脂类物质，不能有效地提高样品的电子反差。（2）、锇酸是一种强氧化剂，分子量为254.2，水溶液为中性。它对脂类物质固定效果很好，对核蛋白、蛋白质都有较好的固定效果，能有效地提高样品的电子反差。但不能保存糖类物质，对人体的粘膜组织刺激很强，毒性大。用时一定要在通风条件好的环境中进行。2）、缓冲液和固定液的配制（1）、缓冲液的配制在电镜样品制备中。常用的有磷酸和二甲砷酸钠两种缓冲液。A、0.2mol磷酸缓冲液的配制甲液：0.2M的磷酸氢二钠溶液磷酸氢二钠（含2个水分子）36.61g(含7个水分子）53.65g（含12个是分子）71.64g加双蒸水至1000ml乙液：0.2M磷酸二氢钠溶液磷酸二氢钠（含1个水分子）27.60g(含2个水分子）31.21g加双蒸水至1000ml不同PH的0.2M的磷酸缓冲液的配制PH6.46.66.87.07.27.4甲液(ml)13.318.824.530.536.040.5乙液(ml)36.731.225.519.514.09.5B、二甲砷酸钠缓冲液的配制甲液：二甲砷酸钠4.28g加双蒸水至100ml乙液：0.2N的盐酸。按下表混合得不同PH值的缓冲液PH6.46.66.87.07.27.4甲液(ml)505050505050乙液(ml)18.313.39.36.34.22.7（2）、固定液的配制A、0.1M磷酸缓冲戊二醛固定液戊二醛的最终浓度（％）1.01.52.02.53.04.05.00.2M磷酸缓冲液(ml)5050505050505025％戊二醛水溶液(ml)46810121620双蒸水加至(ml)100100100100100100100B、0.1M二甲砷酸钠缓冲戊二醛固定液戊二醛最终浓度（％）1.01.52.02.53.00.2M二甲砷酸钠缓冲液（ml)505050505025%戊二醛水溶液(ml)4681012双蒸水加至(ml)100100100100100对生物样品的固定，戊二醛的常用浓度是2.5％，有时为了加快固定的速度，也常用3.0％的。使用的量一般是样品总体积的10～20倍，对大多数样品固定的时间是12小时以上，也可在本固定液中把样品保存一段时间，但不能太长。C、2%锇酸储存液的配制锇酸一般是0.5克为一个包装，在使用时大多数情况下，先配制成2%的水溶液储存，用时再加等量的0.2M的缓冲液配成1%的使用。由于戊二醛是还原剂，锇酸是氧化剂。所以，如果对同一样品进行戊二醛和锇酸双固定时，戊二醛固定结束，一定要用与配制戊二醛相同浓度和PH值的缓冲液彻底清洗后（清洗的时间一般在2小时以上），才能再用锇酸固定。锇酸的使用浓度是1％（用0.2M缓冲液等比例稀释储存液）的水溶液，在本液中固定的时间不能太长，一般是1.5~2小时。锇酸固定结束，一般用双蒸水清洗样品，直到把锇酸清洗干净。整个固定和清洗时间都应在40C环境中进行（是为了避免液体体积发生变化，造成对组织微细结构的损伤）。三、清洗与脱水1、清洗：在超薄切片制备技术中，清洗主要是指：当用两种化学性质完全不同的固定液对同一样品进行固定时，前一种固定液固定结束，一定要进行彻底清洗后，才能用另一种固定液进行固定。如戊二醛和锇酸双重固定，用戊二醛固定结束，必须用与配制戊二醛所用的相同浓度和相同PH值的缓冲液彻底清洗后，再用锇酸固定。否则会发生不良反应，对样品造成不良影响，甚至损伤样品，使实验失败；再就是用锇酸固定结束，要用双蒸水彻底清洗后，才能进行脱水。清洗的时间一般不少于2小时，中间要换几次新清洗液。2、脱水：用脱水剂逐渐取代掉组织中水分的过程叫脱水。常用的脱水剂有酒精、丙酮。因丙酮对组织内的物质有抽提作用，因此，在制作超薄切片时，组织的脱水都用酒精，很少用丙酮。脱水是采用逐渐提高脱水剂浓度的方法对样品进行逐级脱水。脱水剂设置的浓度级差一般有：50％、70％、80％、90％、100％（2次）。在每级中脱水的时间据材料的质地不同有一定变化，动物组织一般每级20分钟；植物样品应加长脱水的时间。对一些含水多，柔软的样品，应适当增加脱水剂的浓度级差，可从30％开始脱水。3、脱水时的注意事项（1）、整个脱水过程应在较冷的环境中进行（要求4摄氏度）。（2）、在更换液体的过程中一定要避免样品的自然干燥。（3）、当进入高浓度的脱水剂时，要及时盖好容器的盖子，防止空气中的水分进入脱水剂，也要避免低浓度的脱水剂过多的带入高浓度的脱水剂中。（4）、脱水一定要彻底、干净。否则，会造成包埋剂不能渗透到组织细胞的每个部位，使制片失败。四、浸透与包埋1、置换：由于脱水剂酒精不能与包埋剂互溶，所以在浸透之前必须用既能和脱水剂互溶又能与包埋剂互溶的溶剂对经过脱水的样品进行处理（即置换），以便包埋剂渗透到组织细胞的各部位中。常用的置换剂是环氧丙烷。置换的方法是逐渐提高置换剂的浓度，使样品最后进入纯置换剂中，一般用纯酒精和环氧丙烷等量混合液处理样品20～30分钟，再用纯环氧丙烷处理30分钟。即可进行包埋剂的浸透处理。2、浸透：用包埋剂逐渐取代组织中的置换剂并渗透到细胞的各个部位的过程叫浸透。（1）包埋剂的种类及配方A、包埋剂的选择条件：包埋剂的选择在超薄切片样品制备中很关键，因为它是渗入到组织的各个部位，固化后起支撑作用。如果选择的包埋剂不合适，在固化后会出现空泡或硬度和组织的硬度有差别，这样就起不到很好的支撑作用，甚至会使切片失败。一种优良的包埋剂应具备：包埋剂单体的粘度低，这样可便于向组织内渗透；固化后收缩率小，可降低对组织的收缩损伤；耐电子束轰击；在高真空中不便形、不升华；固化后有良好的切削性能。B、包埋剂的种类：根据上述选择条件，可用于制作超薄切片的包埋剂有三种：甲基丙烯酸酯类；聚脂树脂类和环氧树脂类。常用的是环氧树脂（EPON812），它是从国外进口的，它是一种塑料单体，为淡黄色的粘稠的液体。它必须与一定比例的催化剂、固化剂（也叫交联剂）混合后才能使用。常用的催化剂有：2，4，6——三（二甲基苯酚）（简称DMP——30），还有二乙基苯胺，乙二胺等；固化剂有：十二烷基琥珀酸酐（简称DDSA)和甲基内次甲基邻苯二甲酸酐（简称MNA)；使用不同比例的固化剂可以改变包埋剂硬化后的硬度范围。有时为了改变包埋剂的切削性能，在配方中加少量的增塑剂（也叫增韧剂），如邻苯二甲酸二丁酯（简称DBP）。C、常见的包埋剂配方有：国产618树脂（无锡树脂厂生产）配方618树脂6mlDD