微生物学实验讲义

实验一玻璃器皿的洗涤、包扎与灭菌一、目的要求1、熟悉微生物实验所需的各种常用器皿名称和规格；2、掌握对各种器皿清洗方法；3、掌握玻璃器皿的干热灭菌操作过程；4、了解手提式高压蒸汽灭菌锅的结构、使用方法和操作要点。二、基本原理为了保证实验顺利进行，要求把实验用器皿清洗干净。保持灭菌后无菌状态，需要对培养皿、吸管等进行妥善包扎。试管和三角瓶要做棉塞。这些工作看来很普通，如操作不当或不按规定要求去做，会导致实验的失败。因此应看作是微生物实验的基本操作。灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物的营养体，包括芽胞和孢子。灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。细胞内的蛋白质凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强；湿热的蒸汽有潜热存在，从而增加灭菌效力。三、实验器材1、吸管，试管，三角瓶，试管刷，棉花，报纸、包扎绳、去污粉等；2、手提式高压蒸汽灭菌锅。四、实验步骤1、玻璃器皿的洗涤清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，因此，玻璃器皿的清洗是实验前的一项重要准备工作。1）不能用有腐蚀作用的化学试剂，也不能使用比玻璃硬度大的物品来擦拭玻璃器皿；新的玻璃器皿应用酸性溶液（2%的盐酸溶液）浸泡数小时，再用自来水冲洗干净。2）用过的器皿应立即洗涤。3）强酸，强碱，琼脂等能腐蚀，阻塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须到在废物缸内。一般的器皿都可用去污粉，肥皂或配成5%的热肥皂水来清洗。油脂很重的器皿应先将油脂擦去。沾有煤膏，焦油及树脂一类物质，可用浓硫酸或40%氢氧化钠或用洗液浸泡；沾有蜡或油漆物，可加热使之熔融后揩去，或用有机溶剂(苯，二甲苯，汽油，丙酮，松节油等)揩去。4）洗涤后的器皿应达到玻璃壁能被水均匀湿润而无条纹和水珠。2、玻璃器皿的包扎为了灭菌后仍保持无菌状态，各种玻璃器皿（培养皿、三角瓶、试管、移液管等）均需包扎。3、灭菌高压蒸汽灭菌：此灭菌方法用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。1）首先将内层锅取出，再向外层锅加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。注意：切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。2）放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意：不要装得太挤，以妨蒸汽流通；带有面塞的玻璃器皿其口端不要与桶壁接触，以免冷凝水深入面塞。3）加盖，将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓。4）通电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。（本实验用0.1MPa，121℃，20min灭菌）5）灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。注意：压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀。如果压力未降到“0”时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。五、思考题1、高压蒸气灭菌前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降为“0”时才能打开排气阀，开盖取物？2、在使用高压蒸气灭菌锅时，怎样杜绝一切不安全的因素？实验二革兰氏染色技术一、目的要求1、学习微生物涂片、染色的基本技术，并掌握革兰氏染色的方法。2、初步认识细菌的形态特征，掌握无菌操作技术。3、了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性二、基本原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。其基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇脱色，最后用复染剂复染。经此方法后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫—碘的复合物，从而增强了燃料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、脂类质含量低，用乙醇脱色时细胞脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，脂类含量高，所以当被脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增加，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。三、实验器材1、菌种：大肠杆菌2、染色液和试剂：结晶紫、碘液、95%酒精、蕃红染液、石炭酸复红染液、二甲苯、香柏油3、仪器：显微镜、废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸四、操作步骤1、制片：取干净载玻片一块，在载玻片的中央加一滴蒸馏水，用接种环以无菌操作法取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。注意：取菌不要太多；涂片要均匀，不易过厚。2、干燥：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。3、固定：手执玻片一端，有菌面朝上，迅速通过火焰2～3次固定（以薄片背面不烫手为宜，以免破坏细胞形态），热固定的目的是使细菌细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。4、初染：滴加适量（以盖满细菌涂面为宜）结晶紫染色液染色1~2min，倾去染色液，用水小心地冲洗。5、媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，倾去碘液，水洗，用滤纸吸干残存的水。6、脱色：将玻片倾斜，用滴管滴加95%乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。7、复染：滴加蕃红染液复染2～3min，水洗。8、镜检：干燥后，先低倍观察，再高倍观察和油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏阴性菌五、思考题1、简述菌株革兰氏染色后的观察结果（形态、颜色、革兰氏染色反映）。2、分析你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。实验三培养基的制作及灭菌一、实验目的和要求1、掌握配制培养基的一般方法和步骤。2、学习高压灭菌锅的操作方法二、实验原理牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96℃时溶化，一般实际应用时在下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固；二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。三、实验器材1、溶液和试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、可溶性淀粉等。2、仪器试管，酒精灯，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，接种环，牛角匙等。四、实验步骤1、称量：培养基的配方见实验教材附录。2、溶化：在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。3、调pH：在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.6。反之，则用1mol/LHCl进行调节。注意pH值不要调过头，以免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。4、分装：按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面；分装三角瓶的量以不超过容积达一半为宜。5、加塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。应使棉塞长度的1/3在试管口外，2/3在试管口内。6、包扎：加塞后，将全部试管用橡皮筋捆扎好，再在棉塞外保一层牛皮纸或报纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用橡皮筋扎好。用记号笔注明培养基名称，日期。7、灭菌：高压蒸汽灭菌。8、搁置斜面：将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在木条上。9、倒平板：将培养基溶化，待冷至55－60℃时，将几种培养基分别倒平板，每种培养基倒三皿。10、无菌试验：将已灭菌的培养基，置无菌试管内，放在37℃孵箱中培养24小时，将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。五、思考题如何检验灭菌后培养基是否合格？实验四微生物的分离与纯化一、目的要求1、熟悉常用微生物培养基的配制方法。2、学习并掌握各种无菌操作技术，并用此技术进行微生物稀释分离、划线分离接种。3、用平板划线法和稀释法分离微生物。4、认识微生物存在的普遍性，体会无菌操作的重要性。二、基本原理土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此，土壤是微生物多样性的重要插所，也是发掘微生物资源的重要基地，可以从土壤中分离、纯化得到许多有价值的菌株。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的是平板分离法。为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对雪养、酸碱度、浓度和氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某些抑制剂抑制其他菌生长而利于此菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物．再用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离，纯化该微生物，直至得到纯菌株。三、实验器材土样10g，培养箱，培养皿(20个)，试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，移液管，记号笔，酒精灯，试管架，PSA培养基或牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。四、操作步骤1、稀释涂布平板法1）倒平板2）制备土壤稀释液3）涂布4）培养：将高氏Ⅰ号培养基和马丁氏琼脂培养基平板倒置于28℃培养3～5d，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养2～3d。5）挑菌落：将培养出的单菌落进行斜面接种，并分别置于25℃和28℃下培养，此后镜检是否为单一微生物。若有杂菌，继续分离纯化。2、平板划线分离法1）倒平板2）划线3）挑菌：挑取单个菌落接种到斜面上培养，此后镜检是否为单一微生物。若有杂菌，继续分离纯化。五、思考题1、如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。2、接种环（针）接种前后烧灼的目的是什么？为什么在接种前一定要将其冷却？如何判断烧灼过的接种环已冷却？3、无菌操作要注意哪些事项?实验五微生物的培养特征一、目的要求1、了解不同微生物培养在斜面上和液体、半固体培养基中的特征；2、进一步熟练和掌握微生物的无菌操作接种技术。二、基本原理微生物的培养特征是指微生物培养在培养基上所表现出的群体形态和生长情况。一般可用斜面、液体和半固体培养基来检验不同微生物的培养特征。它们培养在斜面培养基上，可以呈丝线状、刺毛状、串珠状、疏展状、树枝状或假根状。生长在液体培养基内，可以呈混浊、絮状、粘液状、形成菌膜、上层清晰而底部显沉淀