动物细胞工程918751228

1、植物细胞工程常用的技术有哪些？2、植物组织培养的过程？3、植物组织培养的理论基础？4、植物体细胞杂交的过程和理论基础？复习：动物细胞工程动物细胞培养动物细胞融合生产单克隆抗体动物细胞核移植动物细胞工程常用技术动物细胞培养是其他细胞工程技术的基础–思考与回忆：•1.动物细胞全能性特点？•随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄。细胞核仍具有全能性。•2.能否用植物组织培养的方法使动物细胞发育成动物个体？•不能。动物细胞和组织在体外培养的过程中，伴随一定的组织分化，不管采用什么手段和培养条件，由于细胞的运动、变化，细胞发生结构功能变异，结果长时间的培养只能使单一类型的细胞保存下来，最终成了简单的细胞培养。本节内容：一、动物细胞培养情境：在治疗烧伤病人时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对一个大面积烧伤的病人来说，自身健康皮肤有限，使用他人皮肤来源不同，而且会产生排异反应。那么，怎样能获得大量的自体健康皮肤呢？1.动物细胞培养的概念：动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.思考：动物细胞培养的目的是什么？与植物组织培养目的相同吗？动物的细胞培养的理论依据（原理）？细胞增殖2.动物细胞培养的原理：细胞增殖定义：人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。胰蛋白酶处理取出组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎单个细胞细胞悬液转入培养瓶内培养（贴壁生长长成单层细胞。有接触抑制现象）。①原代培养3：过程图示原代培养细胞悬液CO2培养箱强调一：细胞贴壁过程■细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。■培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于帖附。■当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。强调二：接触抑制定义：当原代培养的细胞处于接触抑制后,用胰蛋白酶处理,使细胞从瓶壁上脱离下来,然后加入新的培养液,将细胞分离稀释,并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内,这个过程称传代培养.（分瓶培养的过程）②传代培养3.总结：动物细胞培养过程动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液剪碎用胰蛋白酶处理10代细胞转入培养瓶40-50代细胞传代培养无限传代单个细胞加培养液稀释传代10代以内，遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。传代10-50代左右，增长缓慢以至于完全停止，部分细胞核型可能发生变化（遗传物质可能改变）为什么用胰蛋白酶处理？原代培养特点：细胞贴壁、接触抑制继续传代培养少部分细胞获得不死性，细胞突变，遗传物质已经改变，等同于癌细胞。原代培养4.动物细胞培养的条件:1）无菌无毒的环境：适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为36.5±0.5℃。适宜的酸碱度：PH：7.2-7.4液体合成培养基：（糖、氨基酸）、促生长因子、（无机盐、微量元素）等；通常还需加入血浆、血清等天然成分。4）气体环境：2）营养：3）温度和pH：“95％空气+5％CO2”的混合气体培养箱。氧气是细胞代谢必须的；CO2维持培养液的PH。对培养液和所有培养用具无菌处理；培养液中添加抗生素防止培养过程中污染；定期更换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。•主要有：营养物质（糖、氨基酸、无机盐、微量元素、促生长因子）动物血清（10%～20%）等培养液（液体培养基）的成分•血清如：小牛血清等•血浆如：鸡血浆等•组织浸出液可用鸡胚胎浸出液,•水解乳蛋白由乳白蛋白质经水解得到淡黄色粉末,一般可配制成0.5%溶液。天然培养基小资料•根据细胞的生理生化代谢特点,人工配制而成,为细胞提供一个近似体内生存环境,又便于控制和标准化操作•基本成分各种碳水化合物(糖)、氨基酸、维生素、无机盐、生长因子、激素等•常用培养液几十种人工合成培养基小资料问题3：为什么用胰蛋白酶处理？问题1：为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。问题2:为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。问题4：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？动物细胞培养的最适PH值为7.2-7.4，胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2-8.4，胃蛋白酶适宜PH为2.胃蛋白酶在PH为7.2-7.4的动物细胞培养中无活性。问题5：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。问题6:动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？问题7:动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基2、成分中有动物血清等不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体问题8:动物细胞培养的原理：细胞增殖。问题9:目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在10代以内，为什么？10代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。5.动物细胞培养技术的应用:1.蛋白质生物制品的生产如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体2.应用于基因工程主要用于作为受体细胞3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性4.细胞的生理、药理、病理研究如用于筛选抗癌药物植物组织培养和动物细胞培养的比较：比较项目植物组织培养动物细胞培养原理细胞的全能性细胞增殖培养基性质固体培养基液体培养基培养基特有成分蔗糖植物激素葡萄糖促--动物血清培养结果植物体细胞株、细胞系培养目的快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白取材植物幼嫩部分或花药胚胎或幼龄动物的器官或组织其他条件无菌无毒，适宜条件无菌无毒，适宜条件去核注核重组细胞二、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、概念：动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体.2、原理：动物细胞核具有全能性•比较以下细胞的全能性：••受精卵、二分裂球的子细胞•囊胚细胞、多能造血干细胞•单能造血干细胞、•水螅的消化细胞、人的消化细胞细胞具有全能性多能细胞单能细胞高度分化的体细胞3、分类：胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易。动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难4、体细胞核移植过程---示动物克隆---无性繁殖1.）克隆羊多利培育过程：黑面绵羊去核卵母细胞白面绵羊乳腺细胞核细胞核移植重组细胞电脉冲刺激早期重组胚胎胚胎移植另一头绵羊的子宫妊娠、出生克隆羊多利◆特别注意：克隆动物性状与供体动物完全一样吗？不可能！因为：一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（如线粒体DNA）来自于受体卵母细胞.二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。供体受体代孕受体黑面绵羊去核卵母细胞白面绵羊乳腺细胞核a重组细胞电脉冲刺激早期重组胚胎b另一头绵羊的子宫妊娠、出生克隆羊多利1、写出AB所代表细胞工程名称：a表示：b表示:2、实施细胞工程时，所需受体细胞大多采用卵母细胞的原因：体积大，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。3、多利面部毛色是：根据遗传学原理说明判断依据。4、若黑面绵羊的基因型为AA,白面绵羊的基因型为aa，则克隆羊的基因型为核移植胚胎移植白色多利全部的核基因都来自白面绵羊aa◆取供体细胞传代培养10代以内的细胞.为什么？◆用的是去核的减数第二次分裂中期细胞（MⅡ中期）为什么？◆激活方法：◆激活目的：◆促融方法：电刺激◆胚胎移植至代孕受体内妊娠、分娩2.）核移植流程供体：优质高产奶牛受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养）1.体积大，易操作。2.含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。有人说它三个母亲，对吗？核移植流程:1、供体细胞的采集与培养5、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减数分裂进程。6电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎。4、将供体细胞注入去核卵母细胞3、显微操作去除卵母细胞中的核2、受体卵母细胞的采集与体外培养7、胚胎移植入代孕母牛体内8、妊娠分娩与供体遗传物质基础相同的犊牛。胚胎分割：受精卵二等分四等分把每等份分别移植到母体子宫内，迅速繁殖出大批性状相似的个体。•动物的基因组中，一类基因是维持生存的，在各种细胞中都处于活动的状态。另一类基因随着组织器官和发育阶段不同而选择性表达。•分化的细胞内基因的活动很不完全，因此很难像受精卵那样发挥细胞全能性。•胚胎细胞克隆比高度分化的体细胞克隆要容易得多。动物难以克隆的原因5.体细胞核移植技术的应用前景6.体细胞核移植技术存在的问题看书P49-50页定义：指用自然或人工方法，使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。不同基因型的细胞之间的融合就是细胞杂交。三、动物细胞融合动物细胞融合诱导融合的因素：生物法：灭活的仙台病毒诱导融合。利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。化学法：聚乙二醇诱导融合因为聚乙二醇易得、简便，且融合效果稳定，是目前应用最广泛的方法。物理法：离心、振动、电刺激动物细胞融合技术的应用遗传学上：基因定位由于细胞杂交中染色体容易丢失，因此利用杂交细胞检测特定染色体丢失与特定基因产物（蛋白质）减少的对应关系，可以进行基因定位。例如：人-鼠杂交细胞通常丢失人的染色体，可以进行人类基因的定位（如由于1号染色体丢失导致尿苷单磷酸激酶活性丧失，可知该基因位于1号染色体上）免疫学上：利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。用途诱导方法细胞融合的方法植物细胞全能性细胞融合的原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目比较项目植物、动物细胞融合的比较细胞膜的流动性细胞膜的流动性去除细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合物理（离心、振动、电刺激）化学（聚乙二醇）物理、化学方法（同左）灭活的病毒获得杂种植株主要用于制备单克隆抗体回忆：1、抗体的化学本质？球蛋白2、抗体是由何种细胞产生的？效应B细胞3、抗体主要分布在哪？血清4、抗原的特异性取决于什么？抗原决定簇5、抗原决定簇的种类和数目是否相同？不同动物细胞融合的成功应用——单克隆抗体的制备一种抗原只能与相应的抗体发生特异性结合。6、抗原与抗体的关系？一个抗原可以与多个抗体特异结合4脾脏4种效应B细胞B1B2B3B4抗原B1B2B3B4Ab1Ab2Ab3Ab44种特异性抗体问题情境1：长期以来，人们为了获得抗体，采用的就是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。你认为这种做法有什么弊端？产量低，而且机体会产生多种抗体，抗体纯度低，反应不够灵敏，这种情况给临床医学的诊断与治疗带来诸多不便。问题情境2：每个浆细胞只分泌一种特异性抗体，要想获得大量专一性抗体，你能利用前面学习过的动物细胞工程的有关技术来解决问题吗？（1）用单个特定B淋巴细胞进行无性繁殖，形成大量的细胞群体，即克隆。（2）如此克隆出的B淋巴细胞遗传特性高度一致，由它们分泌的抗体化学性质单一、特异性强，叫做单克隆抗体。质疑：（动物细胞培养）在体外培养条件下，一个B淋巴细胞可能无限增殖吗？那么怎样才能获得大量单克隆抗体呢？科勒米尔斯坦1984年诺贝尔医学和生理学奖1975年研究单克隆抗体的制备过程获得成功为什么先注射特定抗原？特定抗原获得的B细胞会是同种的吗？已免疫的B细胞细胞融合第一次筛选（多种）杂交瘤细胞存活HAT培养基筛选：1、淋巴细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能够被氨基嘌呤阻断。但是一般不分裂增殖。2、骨髓瘤细胞是特殊选择的代谢缺陷型细胞，其DNA合成过程只具有D途径，能被氨基嘌呤阻断。3、杂交瘤细胞则既可无限增殖，又具备DNA合成途径。杂交瘤细胞（多种）细胞培养多孔培养板第二次筛选选出能产生特定抗体的细胞群，继续培养。（专一抗体检验阳性细胞