第4章--细胞全能性与器官发

第4章细胞的全能性与器官发生1.植物细胞全能性、脱分化和再分化1.1植物细胞全能性（totipotency）植物细胞全能性是指一个生活的植物细胞，只要有完整的膜系统和细胞核，它就会有一整套发育成一个完整植株的全部遗传信息，在适当的条件下，这些信息可以表达，再生成一个完整植株。细胞的再生潜力与其分化程度呈负相关，就是说细胞分化程度越高其再生能力越低。越老的细胞，其基因的表达就越受到严格的制约，或者说丧失功能或不表现功能的基因越多，所以应尽量选取幼嫩的植物组织作为培养的实验材料。1.2脱分化(dedifferentiation)由失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成一种高度液泡化的呈无定形态的薄壁细胞即愈伤组织的现象（或过程）称为“脱分化”（图3－1）。一个细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决于它在原来所处的自然部位上已经达到的细胞和生理状态（图3－2，见教材p43）。图3－1胡萝卜愈伤组织图3－2不同类型细胞脱分化过程可能进行的程度(引自Gautheret，1966)1.3再分化(redifferentiation)由无分化的愈伤组织的细胞再转变成为具有一定结构，执行一定生理功能的细胞团和组织，进而构成一个完整的植物体或植物器官的现象（或过程），叫做“再分化”（图3－3）。图3－3马铃薯愈伤组织分化出的试管苗1.3.1细胞水平的再分化再分化中首先可见的是细胞壁变厚、假导管细胞的形成及酶水平的变化和明显的机能分化，从而形成各种类型的细胞。1.3.2组织水平的再分化当愈伤组织在高水平生长素条件下，最常见的是维管组织的分化。松散的愈伤组织内含有大量拟分生组织或瘤状结构。致密的愈伤组织内组织分化很少，大多由高度液泡化的细胞组成。1.3.3器官水平的再分化器官水平的再分化又称为器官发生。根据起源不同，器官发生可分为器官型和器官发生型。前者直接由外植体的细胞形成器官原基，继而发育成器官；后者由外植体先形成愈伤组织，再由愈伤组织产生不同的器官原基。1.3.4植株再生离体培养中再分化的主要途径是器官发生途径(organogenesis)和胚胎发生途径(embryogenesis)，原球茎发生、绿色球状体（greenglobularbody,GGB）发生、球状茎原基发生、外植体已存在的器官原基萌发等再生途径由于与器官发生有较密切的关系，将之归入广义的器官发生。器官发生包括四种方式：①先形成芽，后在芽基部长根；②先形成根，再从根基部形成芽；③在愈伤组织不同部位分别形成芽和根，然后根、芽的维管束接通形成完整植株；④仅形成芽或根（如茶树的花粉愈伤组织诱导器官分化时，往往只形成根，而芽的发生则十分困难）。其中①②③种方式可使植株重建。2.愈伤组织培养2.1愈伤组织形成的条件愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类，而是培养条件，其中激素的种类和浓度最为重要（什么激素?）。外植体的类型（如木本植物中的幼态或成年态）和外植体原来在植株上所处的位置（它反映了内源激素的水平）对愈伤组织诱导的影响也不能忽视。2.2愈伤组织形成的过程2.2.1诱导期诱导期又称启动期，是愈伤组织形成的起点和外植体细胞进行分裂准备的时期。在这一时期，外植体上已分化的活细胞在外源激素和其他刺激因素的作用下，外植体细胞大小虽然没有多大变化，但其内部却发生了生理生化变化，细胞内合成代谢活跃，RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大（图3－4）。图3－4油橄榄愈伤组织形成过程中各期细胞形态和RNA含量的变化（引自王凯基等，1981)2.2.2分裂期经过诱导期之后，外植体外层细胞开始迅速分裂，但中间部分的细胞不分裂，形成了一个静止的芯（图3－5）。图3－5胡萝卜愈伤组织分裂期在这一时期由于细胞分裂的速度大大超过了细胞伸展的速率，细胞体积迅速变小，逐渐回复到分生状态，细胞进行脱分化。当细胞体积最小，细胞核和核仁最大，细胞内无大液泡，RNA含量最高时，标志着细胞分裂进入了高峰期（图3－4）。2.2.3形成期形成期是指外植体细胞经过诱导期和分裂期后形成了无序结构的愈伤组织的时期（图3－6）。进入形成期后，细胞的平均大小相对稳定，不再减少，细胞分裂由原来局限在组织外缘的平周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂，结果形成瘤状或片状的拟分生组织称做分生组织结节（p46）。图3－6胡萝卜愈伤组织形成期2.2.4分化期脱分化细胞不断进行分裂，形成愈伤组织。如果在原培养基上培养，细胞将不可避免地发生分化，产生新的结构，如及时转移到新鲜培养基上，愈伤组织可无限制地进行细胞分裂，维持其不分化的状态。2.2.4分化期停止分裂的细胞发生生理代谢变化而形成由不同形态和功能的细胞组成的愈伤组织。在细胞分裂末期，细胞内开始发生一系列形态和生理变化，导致细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞。以上几个时期并不是严格区分的，特别是分裂期和分化期往往可以出现在同一组织块上。2.3愈伤组织增殖的方式为了研究愈伤组织在培养期间的形态变化，Caplin（1947）把已建成的烟草愈伤组织切成小方块，置于琼脂培养基上培养，结果发现，愈伤组织的生长是发生在不与琼脂培养基接触的表面。由于小方块组织迅速增殖，加之在其表面或近表面瘤状物的生长，数周之后小方块变成了一个表面不规则的菜花状组织。（图3－7）。图3－7愈伤组织的生长发生在不与琼脂培养基接触的表面2.4愈伤组织状态的调控2.4.1优良愈伤组织的特性（p47－48）（1）高度的胚性或再分化能力（2）容易散碎（3）旺盛的自我增殖能力（4）经过长期继代保存而不丧失胚性2.4.2优良愈伤组织获得的方法（1）选择适当的基因型和适当的外植体（2）选择正确的培养基，特别是正确的植物激素的种类和浓度，以及在需要配合使用生长素和细胞分裂素时，二者之间正确的配比。（3）采用某些特殊的理化因素改变愈伤组织诱导培养基和培养条件2.4.3愈伤组织状态的调控主要根据对小麦、高梁和玉米等禾谷类植物体细胞愈伤组织培养的研究，王海波（1991）将愈伤组织分为3种主要类型（p48）：类型I：保守分裂型，结构致密，生长较慢，容易分化成苗。类型Ⅱ：亢进分裂型，结构松脆，生长旺盛，色泽鲜艳，增殖很快。类型Ⅲ：衰败型，结构疏松，生长缓慢，色泽暗淡。调控因子：最主要的是植物激素和氮源形态。生长素是促使细胞进入亢进状态的因子，细胞分裂素是促使细胞进入保守状态的因子。氮源除了供给培养物氮素营养外，还原态氮还具有促进细胞分裂的作用，硝态氮具有抑制细胞分裂的作用。3细胞分化（differentiation）细胞分化是指由于细胞的分工而导致的细胞结构和功能的改变，或发育方式改变的过程。是普通形态结构的细胞，向着不同形态结构的方向发展，从而在机能上也各不相同。植物细胞分化的研究重点是维管组织的分化，特别是木质部成分的分化。3.1影响维管组织分化过程的因子（1）生长素两个实例（p49～50）：一般来说，低浓度的生长素能刺激木质部的发生，在生长素浓度和木质部分化程度之间存在着一种反比关系。在洋丁香愈伤组织中，改变生长素浓度还能导致维管组织分化位置的变化。（2）蔗糖生长素对维管组织分化所起的作用看来在很大程度上取决于糖的存在。当培养基中含有低浓度生长素时，通过改变蔗糖浓度，即可改变愈伤组织块中所形成的木质部和韧皮部的相对数量（p51）。除了蔗糖之外，属于二糖的麦芽糖和海藻糖也能刺激菜豆愈伤组织导管的分化。葡萄糖、果糖和其他单糖则无刺激作用。（3）细胞分裂素和赤霉素现在已有愈来愈多的证据表明，细胞分裂素也可能与木质部发生有关。例子（p51～52）：烟草、大豆、胡萝卜此外也有报道，对于木质部分化来说，在生长素和赤霉素之间存在着一种刺激性的相互作用。（4）物理因子有关物理因子对维管分化的作用研究得很少。在向日葵中，温度若低于17℃，导管分子不能分化，在17～3l℃的范围内，木质部的形成随温度的增加而增加。另外，光对洋紫苏创伤导管的分化有刺激作用。2.5.2细胞分裂对木质部分化的必要性（p52-53)自学内容4器官分化4.1器官分化方式由培养细胞再生完整的植株有两种不同的方式：①茎芽的分化（器官发生，organogenesis）②体细胞胚胎发生somaticembryogenesis区别：根据可见的形态差异来区别(图3－8)。图3－8在活体和离体条件下胚（A,D,F）和茎芽（B,C,E）的下端在解剖学上的差别。虚线区域代表微管束痕迹（引自Haccius，1978）在组织培养中，通过器官发生途径产生再生植株的基本方式有3种：一是先分化芽，待芽伸长后在其幼茎基部长根，形成完整的小植株。二是先分化根，再在根上产生不定芽而形成完整植株。一般来说，培养物若先形成根，则会抑制芽的形成，但在颠茄的悬浮培养细胞中就可见根上长芽的现象(图3－9)。三是在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，然后二者的维管组织互相连接，成为具有统一的轴状结构的小植株。图3－9颠茄悬浮培养细胞先分化根后形成芽的过程1.在悬浮培养中形成细胞团；2.细胞团上长出根原基；3.许多根原基长成了小根；4.小根脱离细胞团后在根尖的反向一端分化出不定芽；5～7.根和芽逐渐生长形成幼苗4.2影响茎芽分化的因素（1）化学因素影响茎芽分化的化学因素主要是培养基中生长素和细胞分裂素的浓度和比例，当生长素的相对浓度较高时，有利于细胞的增殖和根的分化，若细胞分裂素的相对浓度较高，则促进芽的分化，当这两种激素之间的比例适中时，则仍产生无结构的愈伤组织。另外，在烟草、紫雪花、秋海棠和水稻中，赤霉素对于茎芽的分化有抑制作用。（2）物理因素物理因素包括（p57）：培养基的物理状态培养基的渗透压光照（强度、光周期、光质）温度（2）其它因素在组织培养中对器官分化有明显影响的其他因子包括：培养材料的染色体组、供体植株和外植体的生理状态（分生细胞和胚细胞产生的愈伤组织具有较高的再生能力）、外植体的细胞发育状态、培养物的历史（反复继代保存后形态发生能力下降）以及内生激素水平等。4.3茎芽分化的解剖学和细胞学（自学）4.4表皮细胞的全能性（自学）4.5冠瘿瘤细胞的全能性土壤农杆菌能感染一些植物种类，在宿主组织内诱导产生一种特殊的肿瘤（畸态瘤），称冠瘿瘤。冠瘿瘤细胞的特征是完全无器官分化。但在自然条件下无组织生长的冠瘿瘤细胞，在离体条件下能恢复成完整植株。因此冠瘿瘤被广泛应用于植株的遗传操作。复习思考题：1、简述植物细胞全能性、细胞分化、脱分化与再分化的概念。2、再分化有哪几种方式？它们的特点是什么？3、愈伤组织形成的条件是什么？其形成过程分为哪几个阶段？4、试述优良愈伤组织应用具备的特点及获得优良愈伤组织的方法。5、影响茎芽分化的因素有哪些？