发酵工程-第十章-氨基酸

第十章谷氨酸发酵工业上重要氨基酸简介氨基酸可用作食品、饲料添加剂和药物。过去都采用动植物蛋白提取和化学合成法生产，现18种氨基酸均可采用发酵法和酶法生产，不仅成本下降、污染减少，还可组织大量生产，世界产量每年递增5％～10％。在氨基酸产生菌选育中，过去多采用诱变育种方法，诱变结果不易控制，现采用基因工程和细胞融合技术，产量可成倍、甚至几十倍增加，生产成本大大下降。如用基因重组构建的苏氨酸、色氨酸“工程菌”，比原始菌株提高产量几十倍（产酸达50～60克/升），色氨酸成本从每公斤50美元降到23美元。用细胞融合构建的精氨酸融合株，精氨酸产量达108克/升，比其他生产菌株高2倍多。谷氨酸发酵一、概述早期—从天然的食物材料中取得中期—最早商业化制造味精的原料是面筋近期—糖是生产味精的主要原料二、谷氨酸的生物合成机理1.谷氨酸（-氨基戊二酸）OC-OH第一代鲜味剂H2N-C-HL-谷氨酸单钠盐——味精H-C-HH-C-HH-COOHL-型葡萄糖中间产物a－酮戊二酸谷氨酸谷氨酸脱氢酶NH4＋抑制2.谷氨酸的生物合成葡萄糖6-P-葡萄糖6-P-葡萄糖酸3-P-甘油醛5-P-核糖丙酮酸乙酰CoA草酰乙酸柠檬酸苹果酸异柠檬酸延胡索酸琥珀酸α-酮戊二酸谷氨酸透过细胞膜谷氨酸HMP:Hexosemonophosphatepathway（1）EMP:丙酮酸，ATP,NADH2（2）HMP:6－磷酸果糖3－磷酸甘油酸NADPH2:－酮戊二酸还原氨基化必需的供氢体。（3）TCA循环:生成谷氨酸前体物质－酮戊二酸。（4）CO2固定反应:补充草酰乙酸。（5）乙醛酸循环:使琥铂酸、延胡索酸和苹果酸的量得到补充，维持TCA循环的正常运转。谷氨酸脱氢酶（6）还原氨基化反应:－酮戊二酸谷氨酸丙酮酸回补反应NADHNAD+苹果酸脱氢酶OCOOHCCH2COOH苹果酸酶NADP+CO2NADPHOCH3CCOOHHOHCCH2COOHCOOH3.谷氨酸生产菌的生化特征（1）有苹果酸酶和丙酮酸羧化酶。（2）－酮戊二酸脱氢酶活性弱，异柠檬酸脱氢酶活性强，异柠檬酸裂解酶活性弱。（3）谷氨酸脱氢酶活性高，经呼吸链氧化NADPH2的能力弱。（4）菌体本身利用谷氨酸的能力低。4.谷氨酸产生菌（全是细菌）棒杆菌属北京棒杆菌C.pekinenseCorynebacterium钝齿棒杆菌C.crenatum谷氨酸棒杆菌C.glutamicum短杆菌属黄色短杆菌B.flvumBrevibacterium产氨短杆菌B.ammoniagenes小杆菌属嗜氨小杆菌M.ammoniaphilumMicrobacterium节杆菌属球形节杆菌A.globiformisArthrobacter共同点：1）革兰氏阳性。2）不形成芽孢。3）没有鞭毛，不能运动。4）需要生物素作为生长因子。5）在通气条件下产谷氨酸（需氧微生物）。三、谷氨酸发酵的工艺控制（一）培养基1.碳源：淀粉水解糖、糖蜜、乙醇、烷烃（1）淀粉水解糖的制备（2）糖蜜原料2.氮源：铵盐、尿素、氨水C/N＝100：1521，实际高达100：28因为：1）用于调整pH。2）分解产生的NH3从发酵液中逸出。产酸阶段：NH4+不足：使-酮戊二酸蓄积而很少有谷氨酸生成。NH4+过量：促使谷氨酸生成谷氨酰胺。3.无机盐：磷酸盐、镁、钾、钠、铁、锰、铜，其中磷酸盐对发酵有显著影响。不足：糖代谢受抑制，菌体生长不足。过多：a.细胞膜磷脂生成量多，不利于谷氨酸排出。b.促使丙酮酸和乙醛（由丙酮酸脱羧生成）缩合生成缬氨酸的前体物——－乙醛乳酸，使缬氨酸在发酵液中蓄积。4.生长因子：生物素作用：影响细胞膜通透性和代谢途径。（1）作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，进而影响磷酯的合成。（2）浓度过大：促进菌体生长，谷氨酸产量低。因为：a.乙醛酸循环活跃，-酮戊二酸生成量减少。b.转氨酶活力增强，谷氨酸转变成其它氨基酸。生物素：B族维生素的一种，又称维生素H或辅酶R。是合成脂肪酸所必需的。脂肪酸的生物合成：利用乙酰CoA（直接原料是丙二酸单酰CoA）在乙酰CoA羧化酶（辅基为生物素）催化下合成。脂肪酸＋甘油磷酸磷脂＋蛋白质生物膜因此，脂肪酸是组成细胞膜类脂的必要成分。生物素限量，不利于脂肪酸的合成，有利于谷氨酸透过细胞膜分泌至体外。使胞内代谢产物迅速排出的方法1.用生理学手段——直接抑制膜合成或使膜受缺损•如:Glu发酵中，控制生物素亚适量可大量分泌Glu；•当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉素的方法；2.利用膜缺损突变株——油酸缺陷型、甘油缺陷型•如:用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，培养过程中，有限制地添加油酸，合成有缺损的膜，使细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸产量。•甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量渗漏。应用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸过量的情况下，也可以获得大量谷氨酸。控制细胞膜的渗透性(1)通过生理学手段控制细胞膜渗透性(2)通过细胞膜缺损突变控制细胞膜渗透性生物素谷氨酸细胞膜渗透性青霉素谷氨酸油酸缺陷型油酸工业上利用谷氨酸棒状杆菌大量积累谷氨酸，应采用的最好方法是（）A．加大菌种密度B．改变碳源和氮源比例C．改变菌体细胞膜通透性D．加大葡萄糖释放量为什么添加适量生物素或青霉素可提高谷氨酸产量？生物素：乙酰-CoA羧化酶的辅酶，与脂肪酸及磷脂合成有关。控制生物素含量，可改变细胞膜的成分，改变膜的透性、谷氨酸的分泌和反馈调节。生物素含量高时，细胞膜致密，阻碍Glu分泌，并引起反馈抑制，加适量青霉素可提高Glu产量。青霉素：抑制肽聚糖合成中的转肽酶活性，引起肽聚糖结构中肽桥无法交联，造成细胞壁缺损，在膨胀压的作用下代谢物外渗，降低了谷氨酸的反馈抑制，提高了产量。（二）pH的影响及其控制作用机理：主要影响酶的活性和菌的代谢。在氮源供应充分和微酸性条件下，谷氨酸发酵转向谷氨酰胺发酵。pH控制在中性或微碱性。方法：流加尿素和氨水。（三）温度的影响及其控制菌体生长达一定程度后开始产生氨基酸，菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度不同。菌体生长阶段：3034℃产酸阶段：3436℃（四）溶解氧的控制大小由通风量和搅拌转速决定。发酵产酸阶段，通风量要适量。不足：发酵液pH值偏低，生成乳酸和琥珀酸，谷氨酸少。过大：NADPH2通过呼吸链被氧化，影响-酮戊二酸还原氨基化，使-酮戊二酸蓄积。控制因子产物氧(不足)乳酸或琥珀酸谷氨酸(充足)α-酮戊二酸(过量)NH+4(不足)α-酮戊二酸谷氨酸(适量)谷氨酰胺(过量)生物素谷氨酸(限量)乳酸或琥珀酸(充足)pH(酸性)N-乙酰-谷氨酰胺谷氨酸(中性或微碱性)磷酸盐(适量)谷氨酸缬氨酸环境条件引起谷氨酸合成的代谢转换三、下游过程（一）谷氨酸的提取方法1.等电点沉淀法（1）水解等电点法（2）低温等电点法（3）低温连续等电点法2.不溶性盐沉淀法（1）锌盐法谷氨酸＋锌离子谷氨酸锌沉淀溶液谷氨酸结晶pH6.3加酸pH2.4（2）盐酸盐法：Glu在浓盐酸中生成并析出谷氨酸盐酸盐。这是用盐酸水解面筋生产谷氨酸的原理。（3）钙盐法：高温谷氨酸钙溶解度大，与菌体等不溶性杂质分开，降温，析出谷氨酸钙沉淀，加NaHCO3直接得到味精。3.离子交换法用阳离子交换树脂吸附谷氨酸形成的阳离子，再用热碱（60℃4%NaOH）洗脱，收集相应流分，加盐酸结晶。GA+GA±GA-GA=23.227.012pI谷氨酸是酸性氨基酸，含2个羧基1个氨基，与阴离子交换树脂要比与阳离子交换树脂强，但阴离子机械强度差，价格贵，因而用阳离子交换树脂。理论上讲发酵液上柱的pH值应低于3.22，但实际上控制在5.06.0之间，因Na+、NH4+交换能力谷氨酸，优先交换，置换出H+使pH值低于3.2，使谷氨酸成为阳离子，但不能6.0。4.电渗析法膜分离过程，利用的是电位差。二次电渗析法：pH3.2：除去各种盐类。pH3.2:除去蛋白质、残糖和色素等非电解质。（二）味精制造谷氨酸溶于水活性炭脱色加Na2CO3中和谷氨酸单钠（味精粗品）除铁过滤活性炭脱色减压浓缩结晶离心分离干燥成品我国味精技术进展情况制糖工艺进展：酸法水解→酶酸法水解→双酶法水解。发酵工艺进展：亚适量生物素水平（产酸4～6g／dl）→高生物素水平（产酸12～15g／dl）。提取工艺进展：等电点法（少数锌盐法）→等电离交法→低温连续等电点法（少数厂家采用）。精制工艺进展：全粉炭脱色、硫化碱除铁→颗粒炭脱色、树脂除铁。其它氨基酸发酵一、氨基酸生产工艺控制1、菌种：细菌，野生型或营养缺陷型、结构类似物突变菌种；2、培养基：碳源：淀粉水解糖、糖蜜等；氮源：铵盐、氨水或尿素，豆饼、麸皮粉；无机盐：S、P、Ga、Mg、K等；生物素：影响细胞膜透性，对氨基酸分泌影响很大，来源：玉米浆、麸皮、糖蜜。一、氨基酸生产工艺控制3、发酵条件控制PH：通过流加氨水或尿素来控制；温度：菌体生长和产物形成最适温度不同，并随菌种不同而异；溶氧：不同氨基酸发酵有不同要求；消沫剂：玉米油、豆油或化学合成消沫剂。一、氨基酸生产工艺控制4、氨基酸分离纯化过滤：板框；提取：等电点沉淀；脱色：活性碳，（过滤除活性碳）；精制：离子交换或重结晶法。二、氨基酸（赖氨酸）生产工艺重点：赖氨酸生物合成途径及代谢调节机制；酵母和霉菌的赖氨酸生物合成途径和调节机制；赖氨酸生产菌的育种途径。难点：天冬氨酸族氨基酸生物合成的代谢调节机制。二、氨基酸生产工艺氨基酸本身的合成在不同生物体中，有较大的差异，然而许多氨基酸的合成途径在不同生物体中也有共同之处。按照起始物可将氨基酸的合成分成几个家族：㈠谷氨酸族（α-酮戊二酸族）包括：谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸和脯氨酸；㈡丙酮酸族包括：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸；㈢天冬氨酸族（早酰乙酸族）包括：天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨酸；㈣磷酸甘油酸族包括：甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸；㈤芳香族包括：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；另外，组氨酸的合成为单独的一条途径。氨基酸的生物合成1、天冬氨酸族生物合成途径天冬氨酸族氨基酸合成可以以草酰乙酸或天冬氨酸为原料，合成苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸。天冬酰氨甲硫氨酸琥珀酰高丝氨酸合成酶草酰乙酸→天冬氨酸→天冬氨酸磷酸→天冬氨酸-β-半醛→高丝氨酸→苏氨酸→异亮氨酸DAP合成酶二氨基庚二酸→赖氨酸2、天冬氨酸族生物合成的代谢调节机制在细菌中，虽然天冬氨酸族氨基酸生物合成途径是相同的，但是其代谢调节机制是多种多样的。1）大肠杆菌K12(同功酶调节)①天冬氨酸激酶(三个)②天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(两个)③DDP合成酶（赖氨酸分支的第一个酶）④高丝氨酸合成酶（HD）（通向苏氨酸、蛋氨酸分支的第一个酶）2、天冬氨酸族生物合成的代谢调节机制2）黄色短杆菌(协同反馈抑制)其赖氨酸生物合成调节机制比大肠杆菌简单，其天冬氨酸激酶只有一种，该酶具有两个变构部位，可以与终产物结合，当两种终产物同时过量时，该酶活性受到抑制。3）乳糖发酵短杆菌赖氨酸合成调节3、酵母和霉菌的赖氨酸生物合成途径就赖氨酸合成途径来讲，不同种类的微生物途径不同，可以归纳为两条途径：1）为经过二氨基庚二酸的生物合成途径，如细菌，DAP；2）是AAA，酵母菌、霉菌经过α-氨基己二酸AAA途径合成赖氨酸。4、氨基酸生物合成的调节机制反馈抑制与优先合成氨基酸生物合成的基本调节机制有反馈抑制与在合成途径分支点处的优先合成。反馈抑制：A→B→C→DED优先合成：A→B→CFG5、其他特殊的控制机制1）终产物控制催化分支合成途径共同部分的初始酶，在仅一种氨基酸终产物过剩时，完全不受或微弱或部分地反馈抑制（或阻遏），只是在多数终产物共存下才强烈地控制。有以下几种情况：①协同（或多价）反馈抑制②合作（或增效）反馈抑制③同功酶控制④积累反馈抑制5、其他特殊的控制机制2）顺序控制：EDA→B→CFGA→B→C→D6、赖氨酸生产菌的育种途径出发菌株的选择：要求代谢比较简单的细菌（如黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸发酵短杆菌等）1