乙肝病毒特性与致病机理研究进展

乙肝病毒特性与致病机理研究进展王晓冬，王峰，吕月蒙，李强，张国峰，孙涛，贾亚雄甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州（730070）E-mail：[e-mail]摘要：乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus,HBV)是引起中国及东南亚一带病毒性肝炎的主要病原之一，有半数以上HBV感染的患者将会发展为慢性肝炎(ChronicHepatitis,CH)、肝硬化(LiverCirrhosis,LC)，甚至肝细胞性1fl癌(HepatocellularCarcinoma,HCC)，常被形象的称之为“慢性肝病三步曲”。新近有多项研究表明活化的T细胞反应可能在HBV感染的慢性化和肝细胞损伤过程中起重要作用。CD4+Th细胞可分为Thl和Th2细胞，分别介导两种不同的免疫学效应。Thl细胞主要分泌IL-2,IFN-X和肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子，参与细胞免疫应答;Th2细胞主要分泌IL-4,IL-5,IL-6和IL-10等细胞因子，参与体液免疫应答;Thl/Th2的平衡决定了免疫应答的有效性和安全性。Thl与Th2之间存在相互制约或促进左右，细胞因子组成一个复杂的分子网络，参与调节炎症反应以及器官功能的自我稳定。关键词：细胞因子，乙型肝炎病毒，细胞毒性T淋巴细胞1.引言乙型病毒性肝炎（hepatitisB,HB）是由乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）引起的。HBV的感染不仅可以导致急、慢性病毒性肝炎和重性肝炎，而且还与肝硬化（livercirrhosis,LC）和肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)的发生、发展密切相关。20﹪的慢性乙肝患者将发展成为肝硬化，HBV慢性感染的人罹患HCC的危险性是正常人的100倍。HBV感染呈世界性分布，其中西欧、北美、澳大利亚为低流行区，乙性肝炎病毒表面抗原（hepatitisBsurfaceantigen,HBsAg）携带率在2﹪以下；东欧、日本、南美、北美和地中海国家为中流行区；中国、东南亚与南非为高流行区（HBsAg携带率10﹪左右）。全世界共有约3.5亿人为HBsAg慢性携带者，其中3/4在亚洲。HBV感染导致全球每年50～120万人死亡，其中死于HCC的约占32万。我国是HBV感染的高发区，约60﹪的人群感染过HBV，10﹪的人群为携带者，多达1.2亿。现有乙型肝炎患者约为1200万，年发病率为158/10万[1-4]。随着HBV疫苗在1982年的问世，HBV感染率大大降低，抗病毒药物的出现也使乙型肝炎的治疗取得了一定的进展。但是，乙型肝炎的现状仍然不容乐观，现有乙型肝炎患者及带毒者数量庞大，面临发展为肝硬化和肝癌的危险，不幸的是，到目前为止，还没有针对HBV的特效药物。因此，乙型肝炎的治疗至少在今后50年内仍然是一个严重的问题，寻找更有效的治疗途径是医学研究的重大课题。2.HBV的生物学特性2.1HBV的生物学分类1986年国际病毒革命委员会正式将人类HBV划归为一个新的病毒科——嗜肝DNA病毒科（Hepadnaviridae）的成员。该科病毒成员除了人HBV外还有：（1）东方土拨鼠肝炎病毒（GHV），1978年在美国新泽西州和马里兰州等地的野生土拨鼠发现该病毒。东方土拨鼠肝炎和肝癌的发病率较高；（2）地松鼠肝炎病毒（GHV），是1980年在美国南加州的地松鼠中发现的；（3）鸭乙型肝炎病毒（DHBV），1981年在我国江苏省启东县肝癌高发区分离自易发生肝癌的麻鸭，后来在北京能够鸭和美国商品鸭中也发现此病毒[5-6]。2.2HBV的形态与结构-1-在动物病毒中是不寻常的，是由于在被浸染的细胞中能产生多类型的与病毒相关的颗粒，电镜下观察HBV的提纯制品，证明有三种类型颗粒[7-9]。1.小球型颗粒平均直径为22nm，由空心病毒包膜组成，是HBV多余的衣壳蛋白，没有病毒核酸。无感染性，但刺激机体产生相应的抗体，具有中和病毒的作用，制备乙肝疫苗即由此种颗粒组成。2.管型颗粒由小球型颗粒连接而成，其长短不一。小球型颗粒和管型颗粒的产生是由于病毒颗粒包膜产量过剩。小球型颗粒和管型颗粒与Dane颗粒的比例依不同的病程差异较大，一般撒Dane颗粒的104～108倍，在患者血液中的含量可高达1013个/ml.3.Dane颗粒为完整的具有感染性的病毒颗粒，直径为42nm，由包膜和核衣壳组成。核衣壳直径为27nm，含有HBcAg，单一分子的部分双链DNA以及依赖DNA的DNA聚合酶。核衣壳很重要的一个功能是作为病毒基因组的保护性容器。另一独特的特征是P蛋白与长DNA链共价结合。在患者血液中的Dane颗粒含量为104～106个/ml.图一电子显微镜下可以观察到乙肝病毒3种不同的形态：大球形颗粒，小球形颗粒和管形颗粒[10]-2-图二肝病毒（HBV）结构示意图[10]2.3理化特性及抵抗力在氧化铯平衡梯度离心中，HBV颗粒（42nm）的浮力为1.22g/cm3.表面抗原颗粒（22nm）为1.22g/cm3，病毒外膜成分含有来自宿主细胞的脂类，约占外膜干重的30%。HBV对理化因素有较强的抵抗力。病毒在30～32℃可存活至少6个月，在-20℃可存活15年。病毒浓度高时，60℃加热10h,或98℃加热1min,以及乙醚或pH2。4处理均不能有效灭活乙肝病毒，能够灭活HBV的常用方法和条件包括121℃高压灭菌20min,160℃干烤1h，100℃直接煮沸2min,以及0.5%过氧化酸，3%漂白粉溶液，5%次氯酸钠和环氧乙烷等的直接处理。HBV的感染性并非与其抗原性和免疫原性相一致，在一些能够灭活HBV感染性的条件下，其抗原性和免疫原性-仍可较好保留[11]。2.4HBV的基因组和蛋白组成HBV基因组结构特殊，成不完全闭合的双链形式，负（一）链为全长基因，约含3200个核苷酸，而正（+）链是负链长度的20～80%，病毒颗粒内含有DNA聚合酶。在所有已知可感染人体而且具有独立复制能力的双链DNA病毒中，HBV基因组是昀小但又是昀高效的。它具有以下4个鲜明的特点[12-14]：（1）不完全双链环状结构；（2）利用重叠的开放读码框（openreadingframeORF）编码多个蛋白质；（3）所有调控序列均位于蛋白质编码区内；（4）基因序列具有多变性。-3-基因组基本结构[15]HBV含有4个ORF，即S区（包括preS1、preS2及S）、C区（包括preC和C）、P区和X区[16]，ORF之间互相重叠。HBV有4种转录子，共用一个PolyA加尾信号，长度分别为3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7kb（图）。4种mRNA合成7种病毒蛋白，即外膜蛋白（大、中、主蛋白）、核壳蛋白（前C和C蛋白）、X蛋白和P蛋白[17]。外膜蛋白由S基因区编码，包括3种外膜成分：主蛋白（smallprotein,Sprotein,即HBsAg）、中蛋白（middleprotein,Mprotein,即preS2+HBsAg）和大蛋白（largeprotein,Lprotein,即preS1+preS2+HBsAg）,主蛋白在3种成分中含量昀高。主蛋白和中蛋白由2.1kbmRNA翻译而来，而大蛋白则是2.4kbmRNA的产物。HBV的外膜蛋白构成病毒的外壳包裹颗粒，使病毒能够附着和侵入新的细胞。大蛋白在病毒与细胞受体的结合、病毒颗粒的包装和自细胞向外分泌的过程中发挥重要作用。此外，外膜蛋白还含有引起宿主免疫反应的抗原表位，能够刺激机体产生保护性免疫应答。核壳蛋白由HBV基因组的C区编码，存在两种形式：核心抗原（HBcAg）和e抗原(HBeAg).HBcAg分子量21KD，是病毒核壳的组成成分，在病毒复制过程中负责对前基因组RNA包装，这是基因组复制的必备步骤。HBcAg有较强的免疫原性，几乎所有的HBV感染者均产生针对HBcAg的抗体。HBeAg是分泌性蛋白，先由preC+C区编码带有信号肽的24KD的前体蛋白，前体蛋白进入高尔基体被蛋白酶切割后形成16KD成熟分子进入病人的血液中，HBeAg可诱导机体产生相应的抗体，其功能尚不清楚。HBcAg和HBeAg均是3.5kbmRNA的翻译产物。P蛋白即聚合酶（polymerasa,Pol）由P基因区编码，是一个含816个氨基酸的大蛋白，也是3.5kbmRNA的翻译产物。目前已经发现P蛋白具有4个功能性结构域，P蛋白参与病毒基因组复制的全过程，每一个结构域在基因组复制过程中都发挥不同的作用。HBV前基因组RNA反转录过程中的几个关键步骤，包括RNA的包装、DNA合成所需的引物、以RNA和DNA为模板合成DNA以及将RNA-DNA杂交体中的RNA消化等，均涉及P蛋-4-白的功能。由于P蛋白的重要性，使其成为抗病毒药物的主要靶点。X蛋白由X基因区编码，其转录子为0.7kbmRNA。X蛋白具有多种功能。它可反式激活HBV本身的、其它病毒或细胞的调节序列，还可以激活蛋白激酶C，从而影响细胞信号转导。病毒在体内复制和传播也需要X蛋白的参与[18-21]。2.5HBV的复制在HBV的复制过程中，昀突出的特点是，作为DNA病毒，HBV不以DNA为模板进行复制，而是将DNA转录RNA中间体（RNAintermediate）或称前基因组RNA，再逆转录成DNA进行复制，与逆转录病毒的复制过程类似。HBV的复制过程有以下几个环节[22]：（1）侵入：病毒颗粒的外膜蛋白和宿主细胞膜上的受体（至今不清楚）结合，脱去外壳核心颗粒进入细胞质，进而脱去核壳，病毒DNA及聚合酶进入细胞核；（2）修复：HBV聚合酶修复不完整的正链，使其与负链完全互补，形成共价闭合环状DNA（covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA）,即超螺旋结构，是病毒复制的重要标志；（3）转录：宿主RNA聚合酶Ⅱ以cccDNA为模板，转录出长短不一的mRAN,这些mRNA分子从细胞核转移到细胞质；（4）复制：mRNA分子在细胞质内被翻译成外膜、核心、X和聚合酶等多种蛋白。3.5kbmRNA被成为前基因组RNA（pregenomicRNA,pRNA）,含有病毒编码的全部遗传信息，既是蛋白质翻译的模板，也是HBV基因组复制时反转录的模板。在细胞质内，核心蛋白包裹pRNA和聚合酶形成新生的核心颗粒，病毒复制即在其中进行：先由病毒自身的聚合酶以pRNA为模板，逆转录出负链DNA，pRNA被降解：再以负链为模板，合成正链DNA，形成部分双链的环状DNA，即成熟的病毒基因组；（5）循环：一小部分含有病毒基因组的核心颗粒重新进入细胞核，以维持核内一定量的cccDNA；（6）释放：大多数新形成的核心颗粒出芽到细胞质，装配好病毒的外壳，形成成熟的病毒颗粒释放到细胞外。图四HBV的复制过程[23]-5-的致病性与免疫性乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus,HBV)是引起中国及东南亚一带病毒性肝炎的主要病原之一，有半数以上HBV感染的患者将会发展为慢性乙型肝炎(ChronicHepatitis,CH)、肝硬化(LiverCirrhosis,LC)，甚至肝细胞性1fl癌(HepatocellularCarcinoma,HCC)，常被形象的称之为“慢性肝病三步曲[24]。HBV感染后导致乙型肝炎的致病机制迄今尚未完全阐明。目前学者们一致认为乙型肝炎病人肝脏损伤并不是病毒在肝内复制的直接结果，而是机体对HBV表达产物的免疫导致反应机制所致[25]。人体被HBV感染后，可产生免疫应答反应：（1）体液介导的免疫反应：受乙肝病毒感染后，机体可产生三种抗体，抗HBs、抗HBc及抗HBe。抗HBs一般在感染HBV后4周出现，对乙肝有保护作用。据报道，在医务人员中，有抗