酶工程

第二章酶工程基础酶工程EnzymeEngineering武秋立东南大学医学院生物工程学系Email：[e-mail]22Contentsofchapter2第一节酶的基本概念第二节酶的活力测定第三节酶分子的结构与功能第四节酶促反应动力学3第一节酶的基本概念一、酶的分类二、酶的命名三、酶的催化特性44什么是酶？酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子，所以又称为生物催化剂Biocatalysts。酶催化的生物化学反应，称为酶促反应Enzymaticreaction。在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物substrate。第一节酶的基本概念55一、酶的分类（一）蛋白酶的分类（二）核酸类酶（R酶）的分类（三）国际系统分类法第一节酶的基本概念66单体酶肽链寡聚酶多酶体系多酶复合体多功能酶（一)、蛋白酶的分类根据酶蛋白的分子特点分类：第一节酶的基本概念77单体酶，寡聚酶，多酶体系1、单体酶(Monomericenzyme)：由一条多肽链构成的酶。大多数的水解酶。2、寡聚酶(Oligomericenzyme)：由几个或多个亚基组成。亚基之间以非共价键结合。如：糖代谢的酶。第一节酶的基本概念883、多酶体系(Multienzymesystem)：由几个功能上相关的酶嵌合而成的酶的络合物。多功能酶（multifunctionalenzyme）：一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，形成由一条多肽链组成却具有多种不同催化功能的酶。单体酶，寡聚酶，多酶体系丙酮酸脱氢酶系（E.coli）：丙酮酸脱氢酶（EⅠ）、硫辛酰转乙酰酶（EⅡ）和二氢硫辛酰脱氢酶（EⅢ）。EⅠEⅡEⅢ碱性EⅠEⅡEⅢ+EⅡEⅢ+脲第一节酶的基本概念99（二）、核酸类酶（R酶）的分类核酸酶ribozyme：是非蛋白酶。它是一类特殊的RNA，能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。根据酶催化反应的类型，可以将R酶分为剪切酶，剪接酶，和多功能酶等三类。根据R酶的结构特点不同，可分为锤头型R酶，发夹型R酶，含I型IVS的R酶，含II型IVS的R酶等。第一节酶的基本概念1010（三）、国际系统分类法1961年国际酶学委员会（EnzymeCommittee,EC）根据酶所催化的反应类型和机理分为：类别占总酶比例%利用率%水解酶hydrolases2665氧化还原酶oxidoreductases2725转移酶transferases245裂合酶lyases12~5异构酶isomerases5~1连接酶ligases6~1第一节酶的基本概念1111二、酶的命名1、根据其催化底物来命名；如：淀粉酶2、根据所催化反应的性质来命名；如：转氨酶。3、结合上述两个原则来命名，如：谷丙转氨酶。4、有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点。如：小牛小肠碱性磷酸酶。1习惯命名法2系统命名法系统名称包括底物名称、构型、反应性质，最后加一个酶字。第一节酶的基本概念1212系统名、惯用名举例。乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+惯用名：只取一个较重要的底物名称和反应类型。乳酸脱氢酶对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。例：系统名：包括所有底物的名称和反应类型。乳酸：NAD+氧化还原酶第一节酶的基本概念1313编号：E.C.X.X.X.XE.C:EnzymeCommission，国际酶学委员会缩写乳酸脱氢酶EC1.1.1.27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的序号国际系统命名法第一个数字编号：氧化还原酶：1转移酶：2水解酶：3裂解酶：4异构酶：5合成酶：6第一节酶的基本概念1414三酶的催化特性（一）酶和一般催化剂的共性（二）酶催化作用特性第一节酶的基本概念1515（一）酶和一般催化剂的共性1、用量少而催化效率高。2、它能够改变化学反应的速度，但是不能改变化学反应平衡。3、酶能够稳定底物形成的过渡状态，降低反应的活化能，从而加速反应的进行。第一节酶的基本概念1616（二）酶催化作用特性1．高效性2．专一性3．反应条件温和4.酶活力可调节控制第一节酶的基本概念17171．高效性有酶加入比无酶参加反应速度一般要高107-1013例如：2H2O22H2O+O2过氧化氢酶的催化效率为Fe+催化的1010倍。用-淀粉酶催化淀粉水解，1克结晶酶在65C条件下可催化2吨淀粉水解。第一节酶的基本概念1818酶的专一性又称为特异性，是指酶在催化生化反应时对底物的选择性2．专一性Specificity酶作用的专一性结构专一性绝对专一性相对专一性立体异构专一性光学异构专一性几何异构专一性第一节酶的基本概念1919酶作用专一性的机制相对专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。绝对专一性：只能作用于某一底物。立体异构专一性：一种酶只能作用于一种立体异构体，或只能生成一种立体异构体。第一节酶的基本概念催化理论（1）“三点结合”（2）锁钥学说（3）诱导契合学说2020酶促反应一般在pH5-8水溶液中进行，反应温度范围为20-40C。高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起酶的失活。3．反应条件温和第一节酶的基本概念21214.酶活力可调节控制许多因素可以影响或调节酶的催化活性:1.酶浓度的调节2激活剂调节3.共价修饰调节4.酶原激活5.抑制剂的调节6.反馈调节第一节酶的基本概念22第二节酶的活力测定一．酶活力二．酶活力单位三．酶的比活力四．酶的转换数kcat五．酶活力的测定方法2323酶活力用反应速度表示：反应速度用单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量表示（单位：浓度/时间）。一．酶活力酶活力亦称酶活性:指酶催化一定化学反应的能力。第二节酶的活力测定2424酶反应速度在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶反应速度逐渐下降。原因：A.底物浓度下降B.酶在一定pH及温度下失活C.产物对酶的抑制，产物上升而加速逆反应。所以研究酶的反应速度以酶促反应的初速度为准。一．酶活力第二节酶的活力测定2525二．酶活力单位1个酶活力单位:特定条件下，在1分钟内能转化1µmol底物或催化1µmol产物形成所需的酶量。条件：温度250C,其它条件(pH及底物浓度)均采用最适条件。第二节酶的活力测定2626三．酶的比活力酶的比活力:每毫克质量的蛋白质中所含的某种酶的催化活力，单位/毫克蛋白（U/mg蛋白质)。酶的比活力＝酶活力(单位)/mg(蛋白质或RNA)酶的比活力是比较酶制剂纯度和活力的一个指标。第二节酶的活力测定2727四．酶的转换数Kcat酶的转换数Kcat:单位时间内，酶分子中每个活性中心或每个分子酶所能转化的底物分子数，单位min-1，是酶催化效率的一个指标。如果每个酶分子只有一个催化中心，那么催化中心活性等于摩尔催化活力。摩尔催化活力:每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数。2828五．酶活力的测定方法终止法：在恒温系统中进行酶促反应，间隔一段时间之后，终止酶反应，然后测定反应物的消耗量或产物的生成量，从而计算出酶活性。终止法包括：化学法：如脲酶催化尿素生成NH3和CO2放射性化学法：35P和14C。同位素衰变放出β射线用计数器直接计数。酶偶联法：辅酶NAD+(或NADP+)/NADH(或NADPH)340nm消光系数的变化。第二节酶的活力测定2929五．酶活力的测定方法连续反应法：不需要取样终止反应，而是基于反应过程光谱吸收、气体体积、酸碱度、温度等的变化，用仪器跟踪监测反应，记录结果，算出酶活力。连续反应法包括：光谱吸收法：分光光度计和荧光法。量气法：底物或产物之一为气体。量热法：用量热计测定生化反应热。偶联的连续法:指示酶加到待测酶反应系统中。第二节酶的活力测定3030五．酶活力的测定方法注意：1.测定的必须是初速度：底物消耗在5%以内，或产物生成在15%以内。2.底物浓度、辅因子的浓度必须远远大于酶浓度。3.反应必须在酶的最适条件下进行。第二节酶的活力测定31第三节酶分子的结构与功能一、酶分子的组成二、酶的活性中心与调节中心三、酶催化作用机制3232酶单纯酶结合酶（全酶）=酶蛋白+辅因子一、酶分子的组成酶分子可根据其化学组成的不同，分为两类：单纯蛋白酶：它们的组成为单一蛋白质。结合蛋白酶：某些酶，例如氧化-还原酶等，其分子中除了蛋白质外，还含有非蛋白组分。结合蛋白酶的蛋白质部分称为酶蛋白，非蛋白质部分包括辅酶及金属离子(或辅因子cofactor)。酶蛋白与辅助成分组成的完整分子称为全酶。第三节酶分子的结构与功能3333辅助成分辅因子辅酶与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。辅基与酶蛋白结合得紧密的小分子有机物。金属激活剂金属离子作为辅助因子。辅因子：蛋白酶中非蛋白质部分，它可以是无机离子也可以是有机化合物。酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分。辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。第三节酶分子的结构与功能3434维生素学名辅酶形式作用VB1硫胺素TPPα-酮酸脱氢酶的辅酶VB2核黄素FMN、FAD脱氢酶的辅酶,传递氢原子.Vpp尼克酸NAD+、NADP+不需氧脱氢酶的辅酶VB6吡哆醛磷酸吡哆醛转氨酶的辅酶泛酸遍多酸COA酰基载体叶酸四氢叶酸一碳单位的载体生物素羧化酶的辅酶硫辛酸传递氢VB12钴胺素甲基钴胺素转甲基酶的辅酶辅酶第三节酶分子的结构与功能3535活性部位和必需基团：必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。必需基团活性部位维持酶的空间结构结合基团催化基团专一性催化性质二、酶的活性中心与调节中心第三节酶分子的结构与功能3636酶的结构及催化作用机制1．结合部位Bindingsite酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。2.催化部位酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。第三节酶分子的结构与功能37373.活性部位通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部位或活性中心。结合部位决定酶的专一性催化部位决定酶所催化反应的性质。第三节酶分子的结构与功能3838结合基团活性中心内必需基团催化基团活性中心外必需基团第三节酶分子的结构与功能3939主要包括：亲核性基团：丝氨酸的羟基半胱氨酸的巯基组氨酸的咪唑基。H2NCHCCH2OHOOHOHH2NCHCCH2OHOSHSHH2NCHCCH2OHONNHNNH酶活性中心的必需基团第三节酶分子的结构与功能4040酸碱性基团：天门冬氨酸的羧基谷氨酸的羧基赖氨酸的氨基酪氨酸的酚羟基H2NCHCCH2OHOCH2COHOH2NCHCCH2OHOCOHOCOOHH2NCHCCH2OHOCH2CH2CH2NH2NH2H2NCHCCH2OHOOHOH第三节酶分子的结构与功能41414．调控部位Regulatorysite酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用。第三节酶分子的结构与功能4242三、酶催化作用机制在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶－底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后，中间复合物再分解成产物和酶。E+S====E-SP+E许多实验事实证明了E－S复合物的存在。E－S复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。1、中间产物学说第三节酶分子的结构与功能4343活化能：一定温度下，1mol底物全部转变成活化状态所需要的自由能。催化剂的作用是降低反应活化能Ea,从而起到提高反应速度的作用2.活化能降低第三节酶分子的结构与功能44第四节酶促反应动力学一、单底物酶促反应动力学二、温度对酶反应速度的影响三、pH对酶反应速度的影响4545一、单底物酶促反应动力学底物浓度对酶促反应速度的影响在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速