基因工程改造秸杆发酵产氢的关键技术研究

课题类型：探索导向类申请受理编号：SQ2006AA05Z109513国家高技术研究发展计划（863计划）专题课题申请书技术领域名称：先进能源技术领域专题名称：氢能与燃料电池技术申请指南技术方向：制氢技术课题名称：基因工程改造秸杆发酵产氢的关键技术研究申请人：程军依托单位：浙江大学中华人民共和国科学技术部2006-09-05序号姓名性别出生日期职称职务专业为本课题工作时间(人月)课题组中职务(组长、副组长或成员)在课题中分担的任务所在单位1程军男1974年8月高级职称无环境类24组长项目负责人浙江大学2谢斌飞女1981年10月其他人员无环境类30成员产氢代谢机理浙江大学3戚峰女1980年7月其他人员无环境类30成员秸杆发酵产氢浙江大学4张传溪男1960年1月高级职称副所长生物科学类18副组长基因改造理论浙江大学5刘建忠男1965年2月高级职称无环境类12成员高效产氢工艺浙江大学6李春雨男1973年5月中级职称无生物科学类12成员基因改造秸杆浙江大学7宋文路男1983年7月其他人员无生物科学类30成员产氢菌植入抗性基因浙江大学8鲍艳原女1968年6月高级职称无生物科学类30成员基因改造产氢菌浙江大学9苏会波男1983年12月其他人员无生物科学类30成员产氢菌剔除不利基因浙江大学10潘华引男1985年3月其他人员无环境类30成员秸杆高效水解浙江大学课题参加总人数10人。其中：高级职称4人，中级职称1人，初级职称0人，无职称5人；其中具有：博士学位5人，硕士学位0人，学士学位5人，其他0人；合计：投入246人月2.1课题组长、副组长资历情况（从事过的主要研究任务及所负责任和作用，主要研究成果、发明专利和获奖情况，在国内外主要刊物上发表论文情况，完成其他科技计划课题情况，特别是近五年取得的与本申请课题相关的研究成果情况，字数要求1000字以内）程军，男，1974年8月生，2002年3月浙江大学工程热物理专业博士毕业，现为浙江大学能源清洁利用国家重点实验室副教授，研究领域为微生物制氢以及能源高效清洁利用。在微生物制氢领域作为项目负责人承担了1项国家自然科学基金项目“城市固体有机废弃物以微生物发酵法联产氢气和甲烷的机理研究”、1项全国优秀博士学位论文作者专项资金资助项目、1项霍英东优选资助基金项目和1项浙江省科技攻关项目，作为主要参加者完成了10余项国家和省部级重点科技攻关和基金项目。2001年和2004年两次获得国家科技进步二等奖，2003年获得浙江省科技进步一等奖，2004年获得全国优秀博士学位论文奖。曾合编高校教材1部，在国内外重要学术期刊上发表论文50余篇。致力于对生物质及固体有机废弃物的高效水解及微生物法产氢研究，提出了发酵法联产氢气和甲烷的新工艺，探索了发酵和光合耦合法高效产氢体系，并对秸杆生长细胞和产氢菌株的基因工程改造进行了可行性研究，使系统的能源转化率获得突破性提高，取得了一定的研究成果，已发表和录用重要期刊论文5篇。张传溪，男，1960年1月生，教授，博导。1985年毕业于浙江农业大学植物保护系获硕士学位，1991年赴日本京都工纤大应用生物学科从事生理生化研究，1993年任浙江农业大学副教授，1994.1-97.6在职攻读博士学位，在中国科学院上海生物化学研究所从事分子生物学和基因工程研究，博士学位论文“杆状病毒Ph、PK基因研究及人EPO基因在杆状病毒-昆虫系统中的表达”被评为全国优秀博士学位论文。1998年浙江大学应用昆虫研究所任教授、副所长。2001.5-2003.8年日本学术振兴会特别研究员。现为浙江大学分子生物学实验室教授、博导，主要从事分子生物学和基因工程研究。近年来除从事病毒基因功能研究外，还致力于原核和真核表达、产氢菌株的基因工程改造研究，在产气肠杆菌剔除乳酸基因片段和表达产氢酶基因方面取得了一定的研究成果。学术兼职：应邀任美国国家自然科学基金会（NSF）评审专家、《中国病毒学》编委。曾先后主持4项有关功能基因分析的国家自然科学基金项目和1项教育部专项基金；参加“863”、“973”有关分子生物学和基因工程项目多项。已先后在国内外学术刊物发表有关研究论文100余篇（其中SCI收录32篇），主编著作2本，参编5本，授权专利4项。2.2课题组长、副组长目前承担863计划和其它国家科技计划课题情况（包括人员姓名、承担课题名称、课题经费数、课题起止时间、所属科技计划名称等信息）姓名承担课题名称课题经费数(万元)课题开始时间课题结束时间所属科技计划张传溪基因工程表达AChE基因及其在绿色农药先导物筛选应用502003-9-12008-8-30973计划程军城市固体有机废弃物以微生物发酵法联产氢气和甲烷研究242005-1-12007-12-30其他说明事项：程军副教授负责的该国家基金项目与本次申请863项目的研究目的和内容完全不同，但是都属于微生物发酵产氢研究领域，所具备的科研支撑条件、主要仪器设备以及积累的发酵产氢理论知识和实践经验，可以为本次项目的顺利完成提供良好的平台。张传溪教授负责的该973项目二级课题与本次申请863项目的研究目的和内容完全不同，但是都属于基因工程研究领域，所具备的科研支撑条件、主要仪器设备以及积累的基因工程理论知识和实践经验，可以为本次项目的顺利完成提供良好的平台。2.3课题组长及课题组主要成员是否曾就相同或类似课题863计划和国家其他科技计划提出申请（如有，请说明申请人姓名、申请科技计划名称、申请课题名称、申请时间、申请结果等情况，并说明与本课题申请的关系）无。3.1、课题简介（简要说明课题的目的意义、主要研究内容、预期目标等，字数要求1000字以内）能源与环境是当今世界两大主题，化石能源的日趋匮乏以及燃烧对环境产生的巨大危害要求人类加速研发洁净高效和可再生的新能源。由于氢气具有很高的能量密度，燃烧产物是水，并且没有污染性，故是一种理想的清洁能源。近年来，世界范围内以氢为原料的燃料电池的迅猛发展加速了氢能经济的进程，而以氢的制备、储存和利用为内容的研究开发已成为世界各国竟相争夺的高科技制高点之一。另一方面，我国农村存在量大面广的废弃生物质，如秸秆等大部分直接焚烧的能源利用效率不到30%，造成严重的环境污染和资源浪费。因此，如何高效清洁地利用生物质能成为我国经济社会可持续发展的迫切需求。利用秸杆等生物质以微生物法制取氢气对发展清洁高效的可再生能源和减少环境污染具有重要意义，是一个处于国际学术前沿的热点研究课题，具有重要的学术价值和应用前景。如何使富含纤维素的秸杆等生物质高效降解成可资利用的还原糖是利用其发酵产氢的首要技术难点和重大关键点。而其能否获得产业化应用的瓶颈问题是过程的经济性，目前国际上最新的研究方向是通过基因工程改造产氢菌种和氢酶，并开发高效产氢反应器。因此，本项目提出基因工程改造秸杆发酵产氢的关键技术研究。首先构建转基因水稻，在水稻中转入能在秸杆特异组织中表达（对活体植物茎杆本身无害）的纤维素酶和半纤维素酶等基因，在获得高产量稻谷的同时又能获得在加工过程中被自身植株生长产生的酶高效水解为还原糖的秸秆。其次培养筛选高效产氢菌株，通过knockout技术，剔除产氢细菌Enterobacteraerogenes的乳酸脱氢酶（ldh）等基因，抑制产氢细菌在代谢过程中形成乳酸等的有效途径；同时通过克隆[Fe]-hydrogenase基因，在产氢细菌中转入[Fe]-hydrogenase基因，提高产氢酶表达水平。并且将高效产氢菌Enterobacteraerogenes的产氢酶重组入非产氢抗性菌的基因组，获得耐酸性和其它对环境耐受力强的产氢菌株。研究转基因新型产氢菌的发酵产氢机制及其代谢条件，加入抑制剂提高产氢代谢过程中NADH含量，通过控制代谢途径的导向直接为氢酶提供还原力，以增强其产氢效率。设计高效产氢反应器并优化其运行条件，研究pH值、氧化还原电势和温度等对转基因秸杆发酵产氢过程的影响规律和控制机理。预期目标是使转基因秸杆接种转基因产氢菌的发酵产氢能力和能源转化率获得突破性提高。3.2、课题主要研究技术的国内外发展现状与趋势，课题主要研究技术国内外专利申请和授权情况国际上许多国家投入巨资研究的微生物制氢是一项利用微生物的生理代谢作用分解有机物从而生产氢气的生物工程技术，它是一种符合可持续发展战略的可再生能源技术。它克服了常规制氢方法（如从煤、石油、天然气等化石燃料中提取或通过水电解法制取等）需要消耗大量化石燃料和能量、并且产生大量污染的弊病。目前在生物法制氢研究方面主要分为发酵法和光合法两大类，其中发酵法具有产氢细菌生长速率快、产氢能力高、反应无需光源、发酵底料来源广等优点，所以更容易实现连续产氢和工业化生产。因此，利用秸杆等生物质以微生物法制氢对发展清洁高效的可再生能源和减少环境污染具有重要意义，是一个处于国际学术前沿的十分活跃的热点课题，具有重要的学术价值和应用前景。国内外许多学者关于发酵法产氢的研究范围主要局限于反应机理相对简单的富含水溶性碳水化合物（尤其是葡萄糖）的有机废水，对于主要由复杂大分子有机质即不溶性的大分子碳水化合物、脂类物和蛋白质组成的生物质及固体有机废弃物的发酵产氢问题较少研究。后者的厌氧消化产氢过程可分为水解、酸化和产氢产乙酸三个阶段，由于其降解产氢过程的复杂性，国内外在该领域的研究方兴未艾，目前已逐步引起许多学者的高度重视。国外已有部分相关报道，如日本在90年代末到本世纪初，在暗发酵制氢方面的科研投入大大增加，尤其在2001-2004年产生了大量基础性的研究结果。日本东北大学曾将餐厅剩菜与粪便污泥混合配成培养基料，利用加热预处理的厌氧活性污泥和大豆粉仓中富含的产氢菌进行发酵制氢，发现底料的产氢潜力分别高达140ml/g和180ml/g，而厌氧活性污泥的接种产氢速率可高达45ml/（gVSS•h），2004年日本产业技术研究所的废弃食物产氢项目已经进入中试阶段。另外，韩国、新加坡、印度在此领域的研究也比较活跃。而国内对于固体有机废弃物发酵产氢的研究才刚刚起步，如中国科学院、清华大学、中国科技大学、厦门大学、哈尔滨工业大学、郑州大学等曾对固体废弃物发酵产氢进行了一些探索性研究，取得了一定的研究成果。众多专家一致认为：如何使生物质及固体废弃物高效降解成可资利用的还原糖是利用其发酵产氢的首要技术难点和重大关键点。而生物质发酵产氢能否获得产业化应用的瓶颈问题是过程的经济性，即如何降低发酵制氢的成本，使之可以和化石能源催化重整制氢的经济性相比拟，或者可以与其他生物能源过程（即生物制甲烷、燃料酒精、生物柴油）相竞争。其核心问题是如何提高氢气从葡萄糖的转化率、如何降低底物成本、以及如何在生物反应器水平上实现高效产氢。目前国际上最新的研究方向是从现有产氢纯菌的工艺优化中走出来，开发新的产氢菌种，通过基因工程改造产氢菌及氢酶，并开发高效的产氢反应器。利用富含纤维素的秸杆等生物质大规模高效低成本地发酵转化为燃料乙醇、甲烷或氢气等清洁能源是目前国际上的一大热点课题。若能通过基因工程手段在目标植株细胞中成功表达降解不同生物体高分子的酶，如将纤维素酶基因片段植入水稻的基因组中，而在收获的水稻秸秆中获得大量纤维素酶，使得秸杆在后续的加热到90℃左右水解过程中不需要酸碱预处理和外加纤维素酶等，即能高效降解成产乙醇细菌或产氢细菌直接可资利用的小分子还原糖，则能大幅度降低秸杆水解糖化和发酵利用的处理成本，并大幅度提高其转化效率，取得巨大的经济和社会效益。目前美国麻省理工学院、密歇根州立大学、加州大学Davis分校、杜邦公司和Syngenta公司等正在加紧开展相关的研究探索，主要在玉米、甘蔗等植株生长过程中表达纤维素酶和半纤维素酶，以获得更有利于秸秆高效水解的农作物，但至今很少见到公开的文献报导[1]。厌氧发酵产氢中起主要作用的是氢酶，氢酶分为放氢酶和吸氢酶，分别催化反应222HHe的正逆反应。作为一种有机金属酶类，氢酶对氢代谢至关重要，研究其基因结构和空间结构、催化中心、电子载体种类和传递顺序等具有很高的理论价值，深入发掘这些生物信息对于人们定向改进氢酶性能，获得高产