基因工程的原理和技术

第二节基因工程的原理和技术一、教学目标：1.了解基因工程的基本原理。2.描述重组DNA技术的基本步骤。二、教学重点、难点：基因工程的基本原理和基本操作步骤。一、基因工程的原理和操作步骤：原理：让人们感兴趣的基因（目的基因）在宿主细胞中稳定和高效表达。①目的基因的获取；②形成重组DNA分子；③重组DNA导入受体细胞；④筛选含有目的基因的受体细胞；⑤目的基因表达。二、基因工程操作步骤：1.第一步：目的基因的获取（1）方法：①从基因文库中获取目的基因②利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的基因（目的基因的序列已知）③化学方法合成目的基因（目的基因的序列已知）①从基因文库中获取目的基因用限制酶切成许多片断将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入受体菌的群体储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。②利用PCR技术扩增目的基因聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。循环变性退火延伸目的基因的扩增呈指数形式扩增（2n）人工合成基因的方法反转录法根据已知的氨基酸序列合成DNA③化学方法合成目的基因蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成双链DNA(即目的基因)反转录合成目的基因的mRNA单链DNA(cDNA)③化学方法合成目的基因通过化学合成的目的基因是否含有粘性末端？2、形成重组DNA分子——核心质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个粘性末端3、将重组DNA导入受体细胞转化•常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。•将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。（1）将重组DNA导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法（2）将重组DNA导入动物细胞显微注射技术提纯基因表达载体体外显微注射入受精卵受精卵移植1.将重组DNA导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法2.将重组DNA导入动物细胞显微注射技术（最多、最有效）3.将重组DNA导入微生物细胞Ca2+处理，以增加细菌细胞壁的通透性。抗氨苄青霉素基因α点为目的基因与质粒A的结合点目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高，导入完成后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒A，只有少数导入的是重组质粒。四环素抗性基因怎样筛选出已经导入质粒的细胞？4.筛选含有目的基因的受体细胞抗氨苄青霉素基因α点为目的基因与质粒A的结合点四环素抗性基因在此基础上，怎样鉴别已导入重组质粒的细胞？抗氨苄青霉素基因α点为目的基因与质粒A的结合点四环素抗性基因图a示基因工程中经常选用的载体——pBR322质粒，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。目的基因如果插入四环素抗性基因中，将使该基因失活，而不再具有相应的抗性。abAmprTetrc再将灭菌绒布按到图b的培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布平移按到含四环素的培养基上培养，得到如图c的结果（空圈表示与b对照无菌落的位置）。为了检查载体是否导入原本没有Ampr和Tetr的大肠杆菌，将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素的培养基上，得到如图b的结果（黑点表示菌落）。4.筛选含有目的基因的受体细胞目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记：－－－如以质粒做为载体可进行抗性的检测原理：质粒上有抗生素的抗性基因方法：利用选择培养基筛选①检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因（关键）②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质（表达）（2）常用的技术：①DNA分子杂交技术②蛋白质分子（抗原－抗体）间的杂交5.目的基因的表达（1）内容：（2）基因工程的的原理及技术分子水平：DNA分子杂交技术核心－－DNA探针目的基因的脱氧核苷酸（单链）序列片段用荧光分子或放射性同位素标记看能否形成杂合的双链区检测—鉴定——①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定等过程:A.首先取出转基因生物的基因组DNAB.用含目的基因的DNA片段(单链)用放射性同位素等作标记,以此做探针C.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中方法:DNA分子杂交方法:分子杂交方法:抗原抗体杂交过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA.基因工程的基本操作程序目的基因的获取形成重组DNA分子将目的基因导入受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因表达1、从基因文库中获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、化学方法人工合成农杆菌转化法、显微注射法、Ca2+处理法DNA分子杂交技术、抗原—抗体杂交技术分子检测外的个体水平鉴定本节小结：1.用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述不正确的是A.常用相同的限制性内切酶处理目的基因和质粒B.DNA连接酶和RNA聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶C.可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒D.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达B巩固练习2下列属于获取目的基因的方法的是()①利用mRNA反转录形成②从基因文库中提取③从受体细胞中提取④利用PCR技术⑤利用DNA转录⑥人工合成A．①②③⑤B．①②⑤⑥C．①②③④D．①②④⑥D3.基因工程又叫基因拼接技术。(1)在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径之一是：以目的基因转录的为模板，成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成。(2)基因工程中常用的受体细胞有细菌、真菌、。(3)假设以大肠杆菌质粒作为载体，并以同一种限制性内切酶切割载体与目的基因，将切割后的载体与目的基因片段混合，并加入DNA连接酶。连接产物至少有种环状DNA分子，它们分别是。信使RNA逆转录双链DNA(目的基因)动植物细胞3载体自连的、目的基因片段自连的、载体与目的基因片段相连的环状DNA分子目的基因与质粒的连接基因DNA文库的构建将总DNA经过酶解，分离不同长短的DNA片段。包含的基因片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，感染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因文库。www.1ppt.com基因探针：基因探针就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列。它包括整个基因，或基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。DNA分子杂交示意图采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。基因探针（DNA探针）与目的基因杂交，有无杂交带•传统的遗传育种方法有哪些？•传统的遗传育种方法能否解决不同种生物优良性状的重组问题？•基因工程技术如何解决不同种生物优良性状的重组问题？第一章第三节基因工程的应用基因工程的应用一、基因工程与作物育种二、基因工程与疾病治疗（１）基因工程药物（2）基因诊断（3）基因治疗三、基因工程与环境保护基因工程的应用一、基因工程与作物育种1.抗虫转基因植物2.抗病转基因植物3.其他抗逆转基因植物（如抗盐、抗旱、抗除草剂植物等）4.利用转基因改良植物的品质基因工程在农业上的应用：1）高产、稳产和具优良品质的品种2）抗逆性品种基因工程在畜牧养殖业上的应用:基因工程与疾病治疗基因工程药品的生产•在传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素直接生物体的哪些结构中提取？药品直接从生物的组织、细胞或血液中提取。•传统生产方法的缺点由于受原料来源的限制，价格十分昂贵。•可利用什么方法来解决上述问题？利用基因工程方法制造“工程菌”，可高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。基因工程胰岛素•胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。胰岛素分子结构基因工程胰岛素•将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使其价格降低了30%-50%!胰岛素生产车间基因工程干扰素•干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。干扰素生产车间干扰素分子结构SCID的基因工程治疗•重症联合免疫缺陷（SCID）患者缺乏正常的人体免疫功能，只要稍被细菌或者病毒感染，就会发病死亡。这个病的机理是细胞的一个常染色体上编码腺苷酸脱氨酶（简称ADA）的基因（ada）发生了突变。可以通过基因工程的方法治疗。SCID患者生存在无菌环境中基因治疗SCID的过程基因工程与生态环境保护•基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。